綠茶多酚對表皮HaCaT細胞光損傷的干預作用研究

林向飛等

[摘要]目的：本文旨在觀察沒食子兒茶素沒食子酸酯 （EGCG）對中波紫外線（UVB）引起的表皮HaCaT細胞損傷，以及對細胞著色性干皮病蛋白A（XPA）和切除修復互補交叉蛋白1（ERCC1）蛋白表達的影響。方法：以30mJ/cm2 UVB照射HaCaT細胞，照光前后加入50g/mL EGCG進行干預，Western blot法檢測細胞XPA和ERCC1蛋白的表達水平。結果：UVB照射后細胞內XPA和ERCC1蛋白表達水平逐漸增高，在照光后4h達到峰值，后逐漸恢復至接近正常值；加入EGCG干預可明顯降低XPA和ERCC1蛋白的表達水平。結論：EGCG對紫外線光損傷的干預作用可能與調控細胞內XPA和ERCC1蛋白的表達有關。

[關鍵詞]UVB；HaCaT細胞；XPA；ERCC1；EGCG

[中圖分類號]R75 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2014）17-1401-03

Effects of EGCG on UVB induced the photodamage in HaCaT cells

LIN Xiang-fei1，MIN Wei2，ZHU Xiao-fang1，LUO Dan3

（1.Department of Dermatology，Clinic Medical College of Yangzhou University，Yangzhou 225001，Jiangsu，China；2.Department of Dermatology，The First Affiliated Hospital of Soochow University；3.Department of Dermatology， The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University）

Abstract： Objective To investigate the effects of EGCG on photodamage induced by UVB irradiation XPA and ERCC1 proteins expression in HaCaT cells. Methods HaCaT cells were irradiated with 30mJ/cm2 UVB.50 g/mL EGCG was added into the medium before or after UVB irradiation. Western blot assay was used to measure XPA and ERCC1 expression. Results 30mJ/cm2 UVB irriadiation increased the XPA and ERCC1expression which arrived at the peak at 4h after UVB irradiation.EGCG treatment significantly inhibited the XPA and ERCC1expression. Conclusion The effects of EGCG on UVB induced the photodamage in HaCaT cells maight be related with the inhibitory efficency of EGCG on XPA and ERCC1 expression.

Key words：UVB；HaCaT cell；XPA；ERCC1；EGCG

日光中的中波紫外線（UVB）是導致皮膚光損傷，如日曬傷及皮膚腫瘤發生的最重要的環境因素。UVB可引起表皮細胞DNA損傷和光產物形成，包括環丁烷嘧啶二聚體（CPDs）和6-4光產物（（6-4）PPs）[1-2]。皮膚細胞可通過核苷酸切除修復（NER）機制等對上述DNA損傷進行修復，目前已知30多種基因參與NER過程[3-4]。大量研究證實綠茶多酚具有廣泛的生物學效應，如抗氧化、抗炎、抗腫瘤等[5]。我們的前期實驗表明綠茶多酚主要活性成分EGCG對紫外線引起的皮膚細胞光損傷具有顯著抑制作用[6-8]。本研究將觀察EGCG對表皮HaCaT細胞中DNA損傷修復相關基因產物XPA和ERCC1蛋白表達的影響，從而探討EGCG的光保護作用機制。

1 材料和方法

1.1主要試劑： RPMI 1640培養基（Gibco公司，美國）；小牛血清（杭州四季清生物公司）；EGCG（Sigma公司，美國）；GAPDH、XPA和 ERCC1單克隆抗體（Abcam公司，美國）；PVDF膜（Millipore公司，美國）；ECL（Cell Signaling公司，美國）。

1.2細胞培養：在37 C、5% CO2條件下用含10%小牛血清的1640培養基培養表皮永生化角質形成細胞系HaCaT 細胞。當培養的細胞生長至80%融合時，以0.25%胰酶消化并調整細胞濃度為1×106/ mL，接種到培養皿中繼續培養。

1.3 UVB照射：以SUV-100日光紫外線模擬器（上海SIGMA技術有限公司）對HaCaT細胞進行照射，UVB劑量=UVB輻射度×時間（s），照射劑量為30mJ/cm2。

1.4EGCG干預處理：將HaCaT細胞等量接種于3.5cm培養皿中，于照光后0、1、2、4、8、12和24h收集細胞總蛋白。EGCG處理組分為照光前加藥干預及照光后加藥組，藥物孵育濃度為50 g/mL，于照光后4h收集細胞總蛋白。實驗重復3次。

1.5 Western blot檢測：分離提取細胞總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度。制備10%SDS-PAGE膠，加樣體積為20μl，40mA恒流電泳2h，100V恒壓電泳1h，PBST液洗滌PVDF膜5min/1次，加入一抗，37℃孵育2h；PBST液振蕩洗滌2次，加入二抗（1：200稀釋），37℃孵育20min；ECL顯色顯影，凝膠成像系統掃描分析。

1.6統計學分析：所有數據采用SPSS 11.0統計分析軟件進行處理，以均數±標準差（x±s）表示，組間采用t檢驗，P<0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1UVB對XPA和ERCC1蛋白表達水平的影響：以30mJ/cm2UVB 照射HaCaT細胞，照光后0、1、2、4、8、12和24h收集細胞總蛋白，檢測XPA和ERCC1蛋白表達水平。與對照組相比，UVB照射后細胞內XPA和ERCC1蛋白表達水平均明顯升高，在照光后4h達到最高值，隨后蛋白表達水平逐漸恢復至接近正常水平，但仍高于對照組（如圖1），與對照組相比，XPA和ERCC1蛋白表達水平增高差異有統計學意義（P<0.05）。

2.2 EGCG對UVB引起的HaCaT細胞XPA和ERCC1蛋白表達水平的影響：將細胞分為對照組、EGCG非照光組、照光前加藥處理組、照光后加藥處理組及UVB組。于照光后4h收集蛋白， Western blotting檢測XPA和ERCC1蛋白表達水平。結果表明，與對照組相比， 單純EGCG處理對XPA和ERCC1蛋白表達水平沒有顯著影響；30mJ/cm2UVB照射可明顯升高細胞內XPA和ERCC1蛋白表達水平，而在照光前或照光后加入EGCG干預均可顯著降低XPA和ERCC1蛋白表達水平，差異有統計學意義（P<0.05，如圖2）。

3 討論

人類皮膚是抵抗紫外線損傷的首要防線，其中表皮角質形成細胞是 UVB作用的重要靶細胞。UVB輻射引起的表皮細胞DNA損傷和光產物產生主要通過NER過程進行修復，NER機制包括轉錄伴隨修復（TCR）和全基因組修復（GGR）兩種途徑，其主要步驟有：①識別損傷；②損傷DNA雙鏈解螺旋；③切除損傷部位；④移除包含損傷的DNA延伸鏈；⑤DNA再合成及連接。研究已證實NER過程中有包括XPA、ERCC1、增殖細胞核抗原（PCNA）、p53等30多種基因產物參與其中。XPA特異性識別紫外線或化學性導致的DNA損傷，并且啟動NER起始損傷識別步驟，穩定在DNA損傷位置裝配的多蛋白修復復合體[9]。ERCC1對于損傷DNA的NER修復是必需基因[10]。EGCG是綠茶多酚中最主要和最有效的成分，并有抗突變、抗氧化、抗腫瘤形成、抗炎及調節免疫功能等多種生物學效應。我們在前期研究中業已證實EGCG對人皮膚細胞，包括角質形成細胞和成纖維細胞具有顯著的光保護效能。

本研究主要觀察了UVB和EGCG干預對細胞NER修復途徑中的關鍵調控蛋白XPA和ERCC1表達的影響，籍此闡明皮膚細胞紫外線光損傷和EGCG光保護作用的分子機制。Western blotting檢測結果表明，和非照光組相比，30mJ/cm2UVB照射后，HaCaT細胞中XPA和ERCC1蛋白表達水平均逐漸升高，照光4h后逐漸恢復下降，這表明皮膚細胞經受UVB損傷后，其DNA修復過程發生在照光后立即開始，在4h左右達到高峰并逐漸停止，如DNA損傷未能及時修復，將導致基因突變，甚至皮膚惡心腫瘤的發生。而單純加入EGCG與干預時，細胞XPA和ERCC1蛋白表達無明顯變化，這表明EGCG對皮膚細胞無損傷刺激作用。而在UVB照光前或照光后加入EGCG分別進行干預時，細胞內UVB誘發的XPA和ERCC1蛋白表達水平增高情況均被明顯抑制。這些結果提示EGCG在照光前后進行干預均能顯著抑制UVB輻射引起的細胞DNA損傷，從而表現為較弱的NER修復反應過程。

總之， EGCG可在一定程度上抑制UVB誘發的皮膚細胞XPA和ERCC1蛋白表達，表明EGCG的光保護作用可能與調控上述蛋白表達有關。

[參考文獻]

[1]Krause R.Vitamin D and UV exposure in chronic kidney disease[J]. Dermatoendocrinol，2013，5（1）：109-116.

[2]Battie C，Verschoore M.Cutaneous solar ultraviolet exposure and clinical aspects of photodamage[J].Indian J Dermatol Venereol Leprol，2012，78（Suppl 1）：S9-S14.

[3]Pascucci B，D'Errico M，Parlanti E，et a1. Role of nucleotide excision repair proteins in oxidative DNA damage repair： an updating[J].Biochemistry （Mosc），2011，76（1）：4-15.

[4]Rass K，Reichrath J.UV damage and DNA repair in malignant melanoma and nonmelanoma skin cancer[J].Adv Exp Med Biol，2008，624：162-178.

[5]Khan N，Mukhtar H.Tea and health： studies in humans[J].Curr Pharm Des，2013，19（34）：6141-6147.

[6]Luo D，Min W，Lin XF，et a1.Effect of epigallocatechingallate on ultraviolet B-induced photo-damage in keratinocyte cell line[J].Am J Chin Med，2006，34（5）：911-22.

[7]林向飛，駱丹， 閔瑋，等.UVB輻射后HaCaT細胞光產物的產生和清除及EGCG的干頇作用[J].中國美容醫學，2006，15（4）：384-386.

[8]駱丹，閔瑋，林向飛，等.角質形成細胞與成纖維細胞對中波紫外線照射慮激能力的比較研究[J].中國美容醫學，2004，13（5）：538-540.

[9]Cortat B，Garcia CC，Quinet A，et a1.The relative roles of DNA damage induced by UVA irradiation in human cells[J].Photochem Photobiol Sci，2013，12（8）：1483-1495.

[10]Fadda E.Conformational determinants for the recruitment of ERCC1 by XPA in the nucleotide excision repair （NER） Pathway： structure and dynamics of the XPA binding motif[J].Biophys J，2013，104（11）：2503-2511.

[收稿日期]2014-06-10 [修回日期]2014-07-31

編輯/何志斌