聚合酶鏈式反應PCR技術在環境監測中的應用

高瓊

摘要聚合酶鏈式反應（PCR）技術因其特異性強、靈敏度高以及快速簡便等優點，廣泛應用于環境監測。綜述了改進PCR新技術：逆轉錄PCR、多重PCR、實時定量PCR、免疫捕捉PCR以及PCRDGGE的原理及其在環境監測中的應用現狀。PCR技術為在分子水平上進行環境微生物監測、污染物的生物損傷作用、群落結構多樣性分析提供了有力的試驗手段，具有廣泛的應用前景。

關鍵詞聚合酶鏈式反應；環境監測；應用

中圖分類號S182文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2014）36-12825-04

Abstract Because of polymerase chain reaction （PCR） technologys specificity， high sensitivity， as well as the advantages of quick and easy detection is widely used in the environment monitoring. The principles and the application status quo in environmental monitoring of the improved PCR new technologies such as the reverse transcription PCR， the multiplex PCR， the realtime quantitative PCR， the immunocapture PCR， as well as the denaturing gradient gel electrophoresis technique was reviewed. PCR technology as a powerful experimental tool used for environmental microbial testing， biological damage， microbial structure and diversity analysis at the molecular level， has a broad application prospect.

Key words Polymerase chain reaction； Environmental monitoring； Application

隨著現代工農業經濟發展，環境污染與生態破壞引起了生物個體的基因水平，生物的重組以及環境中物種分布、種群的變化，嚴重威脅人類和其他生物的正常生存與發展。環境的各個組成部分中，生物是核心，最具能動性和靈敏性。應用生物指標監測環境污染，能反映出環境污染對生物的直接影響，更有益于對環境的綜合評價。隨著現代分子生物技術的發展，環境污染監測技術也逐漸由宏觀向微觀轉變，在分子水平上研究致病微生物與指標微生物、有害物質在生物體內的損傷機理、微生物群落的變化。

聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction， PCR）是20世紀80年代中期發展起來的體外核酸擴增技術，該技術具有快速、敏感、簡便、產率高、自動化、特異性強、原始樣品質量要求低等優點，得到了生命科學界的普遍認可。近年來，隨著PCR技術的不斷發展與完善，PCR已從只能單純擴增已知兩端序列之間的DNA片段，發展到應用于各個領域的幾十種PCR研究方法。筆者就目前應用廣泛的PCR技術及其在環境監測方面的應用進行了綜述。

1PCR技術基本原理

PCR技術是一種在生物體細胞外通過酶促合成特異DNA或DNA片段的方法，又稱多聚酶鏈反應、無細胞克隆技術等[1]。該技術利用兩段寡核苷酸作為反應引物，以及4種脫氧核苷三磷酸dNTP、DNA聚合酶作為反應物，將提取到的DNA（稱為模板DNA）片段精確擴增的方法。

PCR反應包括雙鏈DNA（模板DNA）加熱變性為單鏈、引物與模板DNA單鏈結合以及在DNA聚合酶作用下的引物延伸3個階段。其基本過程[2-4]為：環境樣品中微生物經預處理后取得DNA樣板，加熱，在溫度通常高于90 ℃的情況下，使待擴增DNA變性，雙鏈解旋為單鏈DNA；接著在低溫下，一對引物分別與2條DNA的兩端互補性結合，此時兩引物的3′端相對，5′端相背，稱為引物與模板的雜交；之后，在介于前面2種溫度之間的合適溫度下，加上適當的pH及離子強度等，由DNA聚合酶催化引物引導的DNA由5′端向3′端延伸（即以待擴增的DNA為模板合成新的DNA）；從而完成一個變性-復性-延伸的PCR循環，至此完成了PCR的第一輪反應，而后反復進行變性、復性和延伸的循環，從而使擴增DNA產量呈指數上升。如此經過20～30個PCR循環，理論上能產生106～109個待擴增DNA拷貝。PCR擴增產物可用瓊脂糖凝膠電泳進行轉化和檢驗，對被擴增的序列作定性或定量研究；也可以對PCR產物進行克隆用于轉化或測序。

近年來，PCR技術得到了快速發展，其改進形式多種多樣，根據擴增模版、引物序列來源及反應條件不同，目前應用于環境監測中的主要PCR技術有原位PCR、逆轉錄PCR、多重PCR、不對稱PCR、錨定PCR、反向PCR、不對稱PCR、實時定量PCR、免疫捕捉PCR以及多態性分析技術PCRDGGE等[5-7]。這些方法已經在靈敏度、特異性和微型化方面有了很大的發展，為分子生物技術在環境監測的發展提供了便利，在科研領域表現出明顯的優越性。

2PCR技術在環境監測中的應用

2.1應用PCR技術監測環境中的微生物在眾多環境污染物中，生物污染（病原菌、病毒及藍藻等其他一些有害微生物）直接威脅著人類健康和生態平衡。傳統的檢測方法需要對樣品進行分離培養，往往要花上幾天乃至數周，且有些微生物難以人工培養，給快速準確監測帶來困難。由于在微生物中具有一些很強保守性的編碼rRNA基因，因此可用PCR擴增相應的DNA片段，來監測環境樣品中是否存在此種微生物。王中民等[8]建立檢測Mip基因的PCR方法對6株嗜肺軍團菌進行擴增，經典的培養方法時間較長，培養難度大，環境標本中往往存在活的非可培養狀態的軍團菌，該方法擴增出650 bp的條帶，而4株非嗜肺軍團菌和4株非軍團菌未見條帶，表明該方法具有較高的特異性。陳樑[9]利用PCR技術建立了能在12 h內快速檢測大腸桿菌的體系，比標準MF法快60 h，2種方法的檢出率基本一致。

2.2應用PCR技術研究環境污染物對生物損傷作用

當水體、空氣、土壤等環境要素受到污染后，生物不可避免地吸收污染物，并在體內遷移、蓄積，從而遭受污染。因此以生物指標評價環境污染物濃度水平，以及污染物對生物的損傷作用是一個重要的研究課題。侯彥峰等[10]采用實時定量RTPCR方法，對暴露60 d雌二醇的雄性青鳉魚肝臟內卵黃蛋白原和卵殼前體蛋白基因表達進行研究。結果表明，雌二醇使肝臟內VTGI、VTGII、CHGL和CHGH基因表達被顯著誘導，其中VTGI顯示出較好的劑量—效應關系，在0.1 ng/L雌二醇暴露組VTGI和VTGII的表達量均顯著高于對照組（P<0.05），表明該方法可以有效分析環境樣品中微量雌激素物質。王琪等[11]也利用實時定量RTPCR研究雌二醇對青鳉魚肝細胞基因表達的影響，證明該方法靈敏度高于其他已發表的方法。

2.3應用PCR技術研究特定環境中微生物的群落結構、種群豐度以及群落動態

微生物以群落的形式存在于各種環境中，發揮著重要的生態功能。微生物群落的種群結構決定其生態功能。依據微生物基因組DNA的序列信息，通過分析環境樣品中DNA分子的種類和數量，可以反映微生物的區系組成和群落結構[12]。通過提取環境樣品中所有微生物的基因組總DNA，依據核苷酸序列的不同，分析這些DNA的種類和相對數量，即可反映微生物的種類組成以及多樣性信息，從而反映水體、土壤等環境污染狀況。該方法避免了傳統方法檢測周期長、工作繁復、檢測速度慢、制約因素多等局限性。羅海峰等[13]提取不同農田土壤微生物基因組DNA為模板進行PCR擴增，經變性梯度凝膠電泳（DGGE）進行分離分析，結果能很好地反映土壤微生物的群體多樣性。而傳統的平板培養分離方法能分離出的微生物種類只占微生物種類總數的0.1%～1.0%，且不能反映出土壤微生物多樣性的原始狀態，PCRDGGE技術能夠更精確地反映出土壤微生物多樣性。KASUGA等[14]利用PCRDGEE技術對津久井湖進行周期性檢測，分析了該湖微生物群落結構的季節性變化，發現赤潮暴發中主要存在的藍細菌帶。

3改進PCR新技術

3.1逆轉錄PCR

逆轉錄PCR （reverse transcription PCR）是以組織或細胞中的總RNA中的mRNA作為模板，采用oligo（dT）或隨機引物，利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增，從而獲得目的基因或檢測基因表達[15]。逆轉錄PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數量級，是目前靈敏度最高的RNA檢測技術，使一些極為微量RNA樣品的分析成為可能。

張崇淼等[16]建立了一種通用引物逆轉錄PCR技術檢測水中腸道病毒，該檢測方法的靈敏度為38 CCID50，具有較強的抗干擾性，通過考察3種不同水體成分的環境樣品發現，檢測靈敏度基本一致，該方法可應用在實際環境的腸道病毒檢測中。林怡雯等[17]以大腸桿菌和糞腸桿菌作為研究對象，建立一種逆轉錄定量PCR方法，研究表明該方法與傳統培養法之間有較好的線性相關性（大腸桿菌，R2=0.930；糞腸球菌，R2=0.948），可以用于實際水樣活性病原菌的檢測。

3.2多重PCR

多重PCR （multiplex PCR，又稱多重引物PCR或復合PCR），是在同一PCR反應體系里加入2對或2對以上引物，如果存在與各對引物特異性互補的模板，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應[18]。多重PCR微生物檢測主要有2個方向：一是在同一反應管內同時對多個目的基因進行擴增分析，可同時檢測一種或幾種微生物的存在，因此可以大大節省監測時間和試劑；二是針對某一微生物的多個基因進行多重檢測，可以減少假陽性結果的出現，為環境監測提供更多更準確的信息。

范宏英等[19-20]應用多重PCR技術對10個屬的30株細菌進行引物特異性檢測。結果表明，5對寡核苷酸引物都具有較高的特異性和專一性，多重PCR檢測靈敏度達到101～102 cfu，檢測需5～6 h，在水樣檢測的初步應用中得到了均一、穩定、清晰的結果。何偉等[21]建立同時檢測大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、福氏志賀氏菌、銅綠假單胞菌5種土壤常見腸道致病菌的多重PCR檢測技術，結果表明，5對寡核苷酸引物都具有較高的特異性和專一性，檢測限達到104 cfu/g，分析時間僅需3～4 h，極大地縮短了檢測時間，降低了檢測成本，對控制病原菌的傳播具有重要意義。王晶[22]對屏障系統微生物氣溶膠中的易感菌類建立了多重PCR快速檢測方法，該方法能有效檢出金黃葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌和肺炎鏈球菌等。

42卷36期高 瓊聚合酶鏈式反應（PCR）技術在環境監測中的應用

3.3實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR（realtime quantitative PCR）是將熒光能量傳遞技術（fluorescence resonance energy transfer， FRET）應用于常規PCR儀中，指在PCR反應體系中加入熒光基團或熒光染料，利用熒光信號積累，從而實時監測整個PCR過程，最后通過標準曲線對未知模板濃度進行定量分析的方法[23]。實時熒光定量PCR克服了許多常規PCR的缺點，主要有以下幾個特點：①特異性好。實時熒光定量PCR針對靶序列設計特異性探針，具有很高的準確性，假陽性低；②靈明度高。實時熒光定量PCR檢測技術綜合了熒光標記技術、PCR技術、光譜技術、顯像技術，大大提高了檢測靈敏度；③精確性高。利用PCR擴增進入指數期的Ct值與熒光信號之間的線性關系，實現了精確的定量檢測；④操作簡單安全、自動化。由于擴增和檢測在全封閉統一容器內，實現了動態檢測，同時降低了溴化乙錠的污染；⑤測試時間短，效率高。可在2～3 h內完成整個樣品分析。因此實時熒光定量PCR在環境監測領域中有廣泛的應用。

劉永軍等[24-25]通過實時熒光定量PCR方法對西安市5處地表水體中腸道病原細菌的細胞密度進行連續檢測，結果顯示，實時熒光定量PCR法可信度為94%，實時熒光定量PCR檢測結果與大腸菌群、細菌總數以及糞大腸桿菌CFU均呈顯著正相關，秩相關系數分別為r=0.983、r=0.908和r=0.948。徐德順等[26]采用建立的實時熒光定量PCR、常規PCR及傳統細菌培養法3種方法，同時對單核細胞增生性李斯特菌等細菌進行檢測。結果表明，實時熒光定量PCR檢測的靈敏度可達19 cfu/ml，且有很高的特異性，對英諾克李斯特菌等10種相關細菌均無交叉反應，從細菌核酸提取至完成檢測僅需3 h左右。

徐恒省等[27]建立實時熒光定量PCR定量檢測銅綠微囊藻的方法，檢測速度快（整個過程在2 h內完成），能準確定量（與顯微鏡計數相比兩者有良好的一致性），靈敏度高（最低檢測限度約為1個細胞），有利于處理大量的樣本?？梢杂糜谒A時對銅綠微囊藻定量檢測，且可用于低密度時對該藻的實時監測。朱金余等[28]建立了一種檢測水中銅綠微囊藻濃度的定量PCR方法，經定量PCR擴增得到的標準曲線R2為0.968，可以用來檢測樣品中銅綠微囊藻的濃度。

賽林霖等[29]運用實時熒光定量PCR方法，證明壬基酚亞對成體青鳉魚VTGⅠ、VTGⅡ、CHGH和CHGL的基因表達有顯著誘導，說明實時熒光定量PCR能夠檢測1 μg/L壬基酚的環境雌激素效應，具有在現實環境中應用的前景。

趙傳鵬等[30]應用實時熒光定量PCR法，建立了總細菌及假單胞菌屬的標準曲線，并以環境樣本中假單胞菌屬與總細菌的比值反映其細菌豐度。該方法可有效定量假單胞菌屬在環境樣本中的豐度。

3.4免疫捕捉PCR

免疫捕捉PCR（immunocapture PCR）[31]是將免疫捕捉和PCR擴增結合起來的一種檢測方法，其檢測對象是完整的病原體，通過固相化的特異抗體捕捉特定的抗原微生物，再利用其基因組序列特異的引物進行PCR擴增，通過對擴增產物的檢測和分析達到對完整病原體的檢測，這不僅提高了特異性，而且檢測樣本的體積也可增大，從而大大提高了檢測的靈敏度。

楊萬等[32]將免疫捕捉PCR成功用于水中輪狀病毒的檢測。研究發現，該方法靈敏，快速，檢測限為1×104copies/ml，檢測僅需5 h，檢測結果與細胞病變試驗檢測結果有良好的線性相關關系（R2=0.981 6），表明其能較好地表征水樣的病毒感染風險，可用于污水處理廠二級出水、再生水、地表水、自來水等水樣中輪狀病毒的檢測。周純[33]建立了免疫PCR測定4種多環芳烴的方法，該方法比高效液相色譜的線性范圍寬幾個數量級，且檢測線也低，只需將環境樣品簡單預處理后即可直接用于測定。

3.5變性梯度凝膠電泳（PCRDGGE）

變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis， DGGE）技術是DNA指紋技術，是多態性分析技術的一種，其原理[34]：DNA進行電泳時使用具有化學變性劑梯度的聚丙烯酰胺凝膠，該凝膠能夠有區別地解鏈PCR擴增產物。長度相同而在堿基序列上存在差異的不同DNA在進行變性梯度凝膠電泳時，雙鏈的解鏈需要不同的變性劑濃度，序列不同的DNA片段就會在各自相應的變性劑濃度下變性，發生空間構型的變化。在聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度將會急劇下降，以至停留在其相應的不同變性劑梯度位置，染色后可以在凝膠上呈現為分開的條帶，如此便能將具有相同長度而序列有差異的DNA分子分離開。

DGGE技術具有以下特點：①分辨率高?？梢苑直婢哂邢嗤蛳嘟肿恿康哪康钠涡蛄胁町悾梢杂糜跈z測單一堿基的變化和遺傳多樣性以及PCR擴增DNA片段的多態性；②操作簡便。加入1～5 ng的DNA或RNA即可達到清晰的分離效果，電泳可在1 h之內完成，可以同時檢測多個樣品；③重復性好。電泳條件易于控制?？杀ＷC電泳的重現性和結果的重復性。在環境微生物生態學中可以用于分析環境中微生物多樣性；研究環境變化所引起的微生物群落的動態變化；跟蹤相關基因在環境中的表達，分析和跟蹤富集、篩選過程中的菌株。

劉敏等[35-36]利用PCRDGGE技術對2個季節的黃海冷水團海域和長江口外低氧區的細菌群落組成和優勢菌群進行了分析。郭文靜[37]通過DGGE分析成功分離了混合藻，得到3種藻的DGGE圖譜，從而證明PCRDGGE技術是對微藻群進行鑒定的有效方法。李江宇等[38]采用PCRDGGE技術分析大量海水浴場排污口與遠排污口的細菌群落多樣性，并分析浴場中致病菌的豐度。

趙興青等[39]采用PCRDGGE分子指紋圖譜技術比較南京市玄武湖、莫愁湖和太湖不同位置的表層沉積物微生物群落結構。劉新春等[40]應用PCRDGGE方法，對在相同的操作條件下分別用低溫菌和常溫菌接種的兩套活性污泥系統中的微生物群落結構的動態變化進行了追蹤。結果表明，PCRDGGE方法可以在一定程度上反映出系統以及操作條件對微生物群落結構變化的影響。羅海峰等[41]提取不同農田土壤微生物基因組DNA，進行PCRDGGE檢測得到不同數目且分離效果較好的電泳條帶。表明DGGE能夠對土壤樣品中不同微生物的16S rRNA基因的V3區的DNA擴增片斷進行分離，為這些DNA片斷的定性和鑒定提供了條件。與傳統的平板培養方法相比，PCRDGGE技術能夠更精確地反映出土壤微生物多樣性。滕應等[42]提取了重金屬污染農田土壤的DNA，并將其PCR產物進行DGGE檢測，可以明顯反映出重金屬復合污染導致了農田土壤微生物在基因上的損傷，影響到農田土壤生態系統的細菌豐富度，改變了土壤環境的優勢菌群，從而使農田土壤微生物群落結構多樣性發生變化。

4結語

從PCR技術在以上幾個方面的改進及應用可以看出，PCR技術本身有著其他監測手段不具有的優勢，它在環境監測中應用的廣度和深度日益增加，可以對環境的各個方面進行監測。但PCR技術相對于傳統的檢測方法也存在著一些不足如：①假陽性問題。當不相關的核酸分子中存在與模板非常相似的堿基序列時，PCR很可能作出假陽性的結果，所以為了避免假陽性結果的出現必須細心設計合成引物。②污染問題。由于PCR靈敏度高，因而微量靶序列的污染往往對結果造成很大的影響，污染可由試劑引起，也可由試驗設備或者操作引起，故操作過程要十分小心。③樣品生物活性問題。從PCR理論本身來講，任何可以提供核酸物質的樣品都可以進行PCR擴增，不論是死細胞還是活細胞，因此，如何確定檢測的微生物是否具有活性，是個值得考慮的問題。隨著PCR技術的不斷發展與成熟，通過和其他分子生物學技術聯用，技術上會逐漸完善，肯定會被越來越廣泛地應用于環境監測中，從生物角度來監測環境、改善環境。

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