中國柱花草炭疽病病原菌遺傳多態性的AFLP分析

易克賢 鄭金龍 習金根等

摘 要 利用AFLP分子標記技術對181個中國柱花草膠孢炭疽菌菌株進行了基因組DNA分析。分析結果表明柱花草膠孢炭疽菌株DNA存在顯著的多態性。聚類分析結果表明181個中國柱花草膠孢炭疽菌株可劃分成4大組，但大多數聚于第Ⅰ和Ⅱ組，而第Ⅰ、Ⅱ組下又分別分為4個亞組，表明中國柱花草膠孢炭疽菌正在出現種內遺傳分化。同時實驗結果還表明中國菌株存在著廣泛的生物多樣性和遺傳變異性，海南菌株與廣東、廣西的菌株相比多樣性較豐富，致病力更強；而海南菌株又以東方、昌江、中國熱帶農業科學院儋州所部（簡稱“兩院”）3個地區的菌株多樣性最為豐富，毒性譜最廣泛，這可能與海南種植柱花草歷史相對較長、引種活動和生產活動更為頻繁等有關。

關鍵詞 柱花草；炭疽病；遺傳多態性；AFLP；分子標記

中圖分類號 S541+.9 文獻標識碼 A

柱花草（Stylosanthes spp.）又名筆花豆（penciflower），天然分布在中南美洲、熱帶北美洲、非洲及東南亞[1]。是全球熱帶地區栽培面積最大應用最廣泛的優良豆科牧草，它具有產量高、耐旱、耐酸、耐貧瘠等優良特性，適于在熱帶、南亞熱帶地區種植，具有很大的發展潛力[2]。

影響柱花草生產的主要病害是柱花草炭疽病（Stylo anthracnose）。柱花草炭疽病主要由半知菌類炭疽菌屬的膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起，有時亦可由該屬的平頭炭疽菌（C.truncatum）和菜豆炭疽菌（C. lindemuthianum）引起[3]。我國1962年從馬來西亞引入柱花草[4]。自推廣種植以來，由于受到柱花草炭疽病的危害，其產量受到嚴重影響[3]。柱花草炭疽病病原菌存在高度的生物多樣性和遺傳變異性[5]。各國的生產實踐均證明一個抗病的柱花草品種使用10年后就會變成感病品種。而同一品種的柱花草在不同地點的感染程度有差異。炭疽菌分離菌的地理分布與柱花草宿主的自然分布相關。

AFLP技術因具有靈敏度高、快速、多態性強、DNA的用量少、重復性高等諸多優點，已被廣泛用于真菌分類鑒定和遺傳多樣性的研究[6-7]。因此該技術可以檢測到傳統形態學方法無法區分的相似菌株種間和種內差別，它能快速偵測到新的侵染力強的菌株的出現及其種群的消長和遷移動態，便于及時采取相應的措施。

本文是在對我國柱花草炭疽病害調查和病原收集的基礎上，進行病原菌基因組DNA的AFLP多態性分析，以進一步確定我國柱花草炭疽菌的遺傳多態性和病原遺傳分化類型，為我國柱花草炭疽病抗病育種、病害預測及防治等提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1997年至2004年本研究團隊對我國柱花草炭疽病進行了系統調查并分離獲得病原菌703份，從中選取有代表性的181個菌株進行AFLP分析，菌株明細見表1。

1.2 方法

2 結果與分析

用8對引物對181個中國柱花草膠孢炭疽菌株進行分析，每對引物都產生了清晰的AFLP指紋，形成的AFLP圖譜效果如圖1、2、3、4。應用UPGMA法進行聚類，獲得的聚類樹狀圖如圖5、6、7、8。結果表明，中國柱花草膠孢炭疽菌具有豐富的多樣性。181個炭疽菌株之間的相似系數在0.24～0.57之間，同時在相似系數約0.24處聚成4大組。第Ⅰ組共73個菌株，又在相似系數約0.25處分化成4個亞組；第Ⅱ組共60個菌株，又在相似系數約0.30處分化成4個亞組；第Ⅲ、Ⅳ組分別僅有12、20個菌株。以上結果表明中國柱花草炭疽菌正在出現種內遺傳分化。

結合聚類圖5、6、7、8和表2可以看出，Ⅰ-1亞組、Ⅱ-1亞組、Ⅲ組菌株主要來自海南；Ⅰ-2亞組的菌株主要來自廣東；Ⅱ-2亞組、Ⅱ-3亞組菌株主要來自廣西；而Ⅰ-3、Ⅰ-4、Ⅱ-4、Ⅳ組菌株主要來自廣東和海南，結果表明菌株間出現不同程度的地域分布規律。

從表3、4、5還可看出，第Ⅰ組菌株侵染圭亞那、有鉤、粗糙、西布拉等所有的10個柱花草寄主品種，而第Ⅱ、Ⅳ組只侵染其中的5個寄主品種，第Ⅲ組僅侵染其中的4個寄主品種，說明第Ⅰ組菌株的毒力較強，毒性譜非常廣泛，而第Ⅱ、Ⅳ、Ⅳ組菌株的毒性譜較窄。從各省區的菌株組型分布情況看，海南東方、昌江、兩院的菌株多樣性豐富，覆蓋了所有的4個組型，而廣西和廣東菌株則相對簡單。這可能與海南種植柱花草歷史較長、大量從國外引種有關。

3 討論與結論

3.1 柱花草膠孢炭疽菌株DNA存在顯著的多態性

本文采用8對不同的引物對181個來自海南、廣東和廣西的柱花草膠孢炭疽菌株進行了較為全面和系統的AFLP分析，結果表明供試柱花草膠孢炭疽菌株DNA存在顯著的多態性。

181個炭疽菌株之間的相似系數為0.24～0.57，同時在相似系數約0.24處聚成4大組，但大多數菌株聚于第Ⅰ和Ⅱ組。而第Ⅰ組又在相似系數約0.25處分化成4個亞組；第Ⅱ組又在相似系數約0.30處分化成4個亞組；表明中國柱花草膠孢炭疽菌正在出現種內遺傳分化，這與易克賢等人的研究相一致[10]。

3.2 柱花草膠孢炭疽菌株遺傳多態性具有地域性差異

本文的研究結果表明海南、廣東和廣西3省區柱花草膠孢炭疽菌株DNA遺傳多態性豐富程度海南菌株大于兩廣的菌株，而且同一省區內不同地方的菌株其遺傳多態性亦表現出地域性差異。其中海南菌株又以東方、昌江、儋州兩院三地的菌株多樣性最為豐富，毒性譜最廣泛，這可能與各地柱花草的引種活動、推廣種植的時間、規模程度和生態條件差異有關，引種和種植時間越長，病原菌為適應當地環境，遺傳變異和進化必然更加活躍[11]。

3.3 柱花草膠孢炭疽菌株表現出一定程度的專化寄生性

本研究結果表明，第Ⅰ組菌株侵染圭亞那、有鉤、粗糙、西布拉等所有的10個柱花草寄主品種，而第Ⅱ、第Ⅳ組只侵染其中的5個寄主品種，第Ⅲ組僅侵染其中的4個寄主品種，說明第Ⅰ組菌株的毒力較強，毒性譜非常廣泛，而第Ⅱ、Ⅳ、Ⅳ組菌株的毒性譜較窄。

3.4 AFLP可用于柱花草膠孢炭疽菌株種群遺傳變異的監測和抗病育種

國外許多報道[12-14]均表明在柱花草的起源中心-南美和長期種植區其炭疽病菌存在著廣泛的生物多樣性和遺傳變異性，而在新種植區則相對簡單。本文研究表明，與國外研究結果相比，中國柱花草炭疽病菌遺傳多樣性要簡單得多，因此今后從其它國家進行柱花草引種和推廣過程中，應特別注意病原菌的檢疫和病害監測，以防止新的侵染力強的病原菌株或小種從國外或老種植區帶入新區，影響中國柱花草的生產。此外本文研究結果表明中國柱花草炭疽病菌正出現一些新的種內遺傳分化，因此有必要不斷加強綜合抗病品種的選育。

參考文獻

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