三明野生香蕉Ran家族基因DNA序列克隆與生物信息學分析

張雅玲 方智振 賴鐘雄

摘 要 Ran是一類廣泛存在于真核生物中的極為保守的小G蛋白。本研究從三明野生香蕉中分離得到15條Ran家族基因DNA序列，并對基因結構、序列特征和進化關系等進行分析。結果表明，三明野生香蕉Ran家族基因與小果野蕉Ran家族基因高度同源，且具有大量多態性位點。三明野生香蕉Ran蛋白與其他植物Ran蛋白高度同源，帶有GTP水解結構域、RanGAP結合結構域和酸性尾巴等Ran蛋白的典型結構域，與擬南芥AtRan3親緣關系最近。三明野生香蕉中存在大量的Ran家族基因，預示著Ran可能具有重要的作用。本研究結果可為研究三明野生香蕉Ran家族基因的生物學功能奠定基礎。

關鍵詞 野生香蕉；Ran；生物信息學

中圖分類號 S668.1 文獻標識碼 A

香蕉是消費量最大的重要熱帶鮮食水果[1]，面積和產量僅次于柑桔，具有十分重要的經濟地位。中國香蕉主要分布于亞熱帶北緣區域，低溫是影響中國香蕉產業發展的一個重要限制因素[2]。近年來，在中國南方亞熱帶香蕉種植區域冬春寒流頻發，導致香蕉減產、遲產、劣產，甚至絕收[3]。香蕉脅迫響應機制的研究，可為通過栽培措施和遺傳改良提高香蕉抗性提供科學依據，具有重要的意義。

植物不同于動物，只能通過大量基因表達的重編程，表達保護性蛋白，調整自身代謝和結構以適應外界環境條件的變化。各種環境信號需要通過許多特異的調控蛋白傳導到細胞核中以啟動基因的轉錄，并將mRNA運出細胞核并翻譯成蛋白質。特異蛋白的核質分區是調控植物溫度脅迫，光信號轉導，激素信號轉導和抗病性等諸多發育和信號轉導途徑的重要方式[4]。越來越多的證據表明，核質轉運是植物響應激素、脅迫和環境變化等的信號轉導途徑中的一個關鍵步驟[5]。

Ran是一類在真核生物細胞核質運輸中扮演重要角色的極為保守的小G蛋白[6]。Ran與蛋白質和RNA的核質轉運之間密切相關。因此，Ran必然參與植物脅迫響應。超表達OsRAN2可改變水稻對鹽脅迫的敏感性[7]。研究表明，熱脅迫和低溫脅迫可影響植物Ran蛋白的表達[8-12]。Li等[13]研究表明低磷處理可影響玉米根系中Ran B1蛋白的表達。擬南芥Ran-1蛋白參與根系對鹽脅迫響應[14]。Yoshimura等[15]發現Ran蛋白與野生西瓜根系對干旱脅迫響應有關。Zhai等[16]發現長期積水可導致作用于Ran的miRNA的表達發生變化。Lee等[17]研究表明Ran基因可通過光敏色素介導的信號轉導途徑參與不同光源的響應。光脅迫可顯著降低單細胞真核藻類中Ran的表達量[18]。Chen等[11]研究發現超表達OsRAN2可顯著提搞水稻對冷脅迫的抗性。以上研究均表明，植物Ran與植物脅迫響應有關。開展Ran在植物脅迫響應過程中的作用機制研究，對于進一步探索植物脅迫響應調控機制和提高植物抗逆性具有重要意義。

目前，關于Ran的研究主要集中在動物上，植物Ran的研究相對較少。香蕉Ran家族基因的相關研究尚未見報道。本研究以抗寒性較強的三明野生香蕉為材料克隆Ran家族基因DNA序列，并采用生物信息學手段進行分析，以期為進一步研究Ran家族基因在香蕉生長發育過程中的功能與表達調控機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

以三明野生香蕉組培苗為材料。以三明野生香蕉吸芽為外植體進行無菌培養體系的建立，香蕉組培苗每2個月繼代1次，香蕉組培苗的培養與繼代參照張銳[19]的方法。

1.2 方法

1.2.1 三明野生香蕉組培苗葉片DNA的提取 采用CATB法提取三明野生香蕉組培苗葉片的DNA，并用1.0%非變性瓊脂糖凝膠電泳結合超微量紫外分光光度計，選擇符合要求的DNA用于后續研究。

1.2.2 三明野生香蕉Ran基因DNA序列的克隆

1.2.3 三明野生香蕉Ran基因DNA序列及其編碼的Ran蛋白的生物信息學分析 采用DNAMAN 6.0對三明野生香蕉Ran基因DNA序列及其編碼的Ran蛋白進行比對分析。將三明野生香蕉Ran蛋白與擬南芥、毛果楊、葡萄和水稻Ran蛋白序列用MEGA5軟件自帶的ClustalW進行對，并采用鄰接算法進行系統進化樹構建，Bootstrap值設為1 000。用于進化樹分析的擬南芥、毛果楊、葡萄和水稻Ran蛋白序列從植物基因組數據庫（http：//www.phytozome.net/）提取。

2 結果與分析

2.1 三明野生香蕉Ran家族基因DNA序列克隆與序列分析

2.2 三明野生香蕉Ran蛋白氨基酸序列比對和系統進化分析

3 討論與結論

家族成員數少是Ran家族基因不同于其他小G蛋白的一個重要特點，許多物種中均只有1個Ran基因，如人類和裂殖酵母[20]。模式植物擬南芥基因組中含有4個Ran基因[21]。根據全基因組基因預測結果，小果野蕉基因組中Ran家族基因共有9個成員。本研究共從三明野生香蕉中分離得到15條Ran家族基因DNA序列，且這些Ran家族基因僅分別與小果野蕉基因組中的4個Ran家族基因高度同源。三明野生香蕉中可能還存在與其他5個小果野蕉Ran家族基因成員同源的基因。以上結果表明，三明野生香蕉中可能存在大量的Ran家族基因成員。小果野蕉屬于AA類群，僅擁有香蕉的A基因組，而三明野生香蕉屬于AB類群[22]，同時擁有A和B基因組，這可能是三明野生香蕉含有大量的Ran家族基因成員的原因之一。本研究中分離得到的15條Ran家族基因DNA序列中有11條均與小果野蕉基因組中1個成員高度同源。這可能是在香蕉進化過程中發生的全基因組復制或部分基因復制的結果。研究表明香蕉可能經歷過3次全基因組復制有關[23]。三明野生香蕉中Ran家族基因成員的具體數量還有待進一步研究確定。同時，香蕉基因組中大量Ran家族成員的存在預示著Ran基因可能在香蕉的生長發育過程中具有重要的作用。

三明野生香蕉、擬南芥、水稻、毛果楊和葡萄Ran蛋白的序列進行序列比對和系統進化分析結果表明Ran蛋白高度保守。表明三明野生香蕉Ran蛋白可能與其他植物的Ran蛋白具有相同或類似的功能。已有研究表明Ran參與植物脅迫響應。Chen等[11]分析了不同脅迫下水稻OsRAN2的表達模式，發現與鹽脅迫和干旱脅迫相比，低溫可顯著影響OsRAN2的表達，且超表達OsRAN2可通過促進細胞核內微管蛋白的輸出以及維持細胞分裂提高轉基因植株的抗寒性。Paul和Kumar[12]研究發現低溫可導致茶葉休眠組織和旺盛生長的組織中CsRan2表達量上升，而室溫條件下休眠組織中CsRan2表達量下降。用150 mmol/L NaCl處理48 h后，擬南芥根系中Ran-1蛋白的豐度顯著提高，表明Ran可能在鹽脅迫條件下發揮著特殊的作用[14]。鹽脅迫、滲透脅迫和ABA處理可降低水稻OsRAN2的轉錄水平，超表達OsRAN2的水稻和擬南芥植株對鹽脅迫和ABA高度敏感，植株中與ABA和脅迫響應有關的基因表達量提高[7]。低溫和鹽漬等脅迫是導致香蕉生產損失的重要因素。目前，Ran在香蕉脅迫響應過程中的作用的相關研究還未見報道。三明野生香蕉具有較強的抗寒性[22]。本研究的結果為進一步研究Ran在三明野生香蕉對脅迫（尤其是低溫脅迫）響應過程中的生物功能奠定了基礎。

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責任編輯：葉慶亮