芭蕉屬植物內(nèi)生細(xì)菌種群分布特性研究

陳璐等

摘 要 從4種芭蕉屬植物的10個(gè)不同部位組織中分離內(nèi)生細(xì)菌，并用Sherlock MIS微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)進(jìn)行脂肪酸鑒定，分析芭蕉屬植物內(nèi)生細(xì)菌種類及數(shù)量分布特性。結(jié)果表明：不同種類芭蕉屬植物內(nèi)生細(xì)菌含量存在較大差別，其中威廉斯香蕉內(nèi)生細(xì)菌含量最高，達(dá)8.809×108 cfu/g，而芭蕉和紅花蕉含菌量最低，分別為2.022×105 cfu/g和2.171×105 cfu/g。在同一種類的不同器官組織中，內(nèi)生細(xì)菌的含量也有所不同。共分離得到64株內(nèi)生細(xì)菌，可鑒定的菌株有23株，劃分為14個(gè)種群，隸屬于11個(gè)屬，數(shù)量最多、分離頻率最高的3種內(nèi)生細(xì)菌為傷寒沙門氏菌（Salmonella typhi）、克雷白氏桿菌（Klebsiella pneumoniae）、赫替假單胞桿菌（Pseudomonas huttiensis）。根據(jù)這14種內(nèi)生細(xì)菌的分布情況顯示，不同種內(nèi)生細(xì)菌在種群數(shù)量分布上差異顯著。

關(guān)鍵詞 芭蕉屬；內(nèi)生菌；種群；脂肪酸鑒定；分布

中圖分類號(hào) Q949；S432 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Distribution of Endophytic Bacteria from Genus Musa Plants

CHEN Lu1，2，3， LIU Bo1 *， XIAO Rongfeng1， SHI Huai1， ZHU Yujing1， LAI Zhongxiong3 *

1 Agricultural Bioresource Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China

2 Institute of Landscape Gardening， Quanzhou Gardens Administration Bureau， Quanzhou， Fujian 362000， China

3 Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract A total of 64 endophytic bacterial strains were isolated from four plant species of Musa， and identified by fatty acid technology in Sherlock MIS（microbe identification system）. The species and the quantity distribution of endophytic bacteria were studied. The results showed that a great difference was found in the amount of endophytic bacteria among different species of Musa genus plants. The amount of endophytic bacteria in Musa spp. cv Williams（AAA group）was the highest， and the content reached 8.809×108 cfu/g；and it was the lowest in Musa spp.（ABB group）and Musa coccinea， with the contents of to 2.022×105 cfu/g and 2.171×105 cfu/g. In different organs of the same species， the amount of endophytic bacteria was different. Only 23 lines of the endophytic bacteria could be identified and classified into 14 species and 11 genera. The largest numbers and highest frequency of three kinds of those isolated endophytic bacteria were Salmonella typhi， Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas huttiensis. The distribution of the 14 bacterial species showed that there were differences in the amount distribution of different species of endophytic bacteria.

Key words Musa； Endophyte； Species； Fatty acid identification； Distribution

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.029

植物內(nèi)生細(xì)菌是指其生活史的某一個(gè)階段或整個(gè)階段生活于健康植物各種組織和器官內(nèi)部或細(xì)胞間隙、正常情況下它們的存在并未使植物組織的表型特征和功能有明顯改變的細(xì)菌[1-2]。目前在各種農(nóng)作物及果樹等經(jīng)濟(jì)作物中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生細(xì)菌已超過129種，分別屬于54個(gè)屬。主要有：芽孢桿菌屬（Bacillus）、黃單胞菌屬（Xanthomonas）、假單胞桿菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）及短小桿菌屬（Curtobacterium）等[3]。近年，利用內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行植物病害的生物防治已成為研究熱點(diǎn)。植物內(nèi)生細(xì)菌生防機(jī)制主要有產(chǎn)生抗生素、誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生系統(tǒng)抗性、滅活病菌萌發(fā)因子和產(chǎn)生胞外酶溶解病原菌細(xì)胞壁等幾種方式[4]。植物內(nèi)生細(xì)菌可能具有宿主特異性，且在宿主不同器官中，其類群數(shù)量消長動(dòng)態(tài)各有不同[5]。了解內(nèi)生細(xì)菌的分布規(guī)律對(duì)有效利用內(nèi)生細(xì)菌防治植物病害具有重要意義。本研究對(duì)芭蕉屬植物內(nèi)生細(xì)菌的種群分布特性進(jìn)行了研究，以期為進(jìn)一步從芭蕉屬植物內(nèi)生細(xì)菌中篩選芭蕉屬植物病害拮抗菌株、研究防治方法及其防病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

野生蕉（Musa spp.，AB group）、芭蕉（Musa spp.，ABB group）、威廉斯香蕉（Musa spp. cv Williams，AAA group）、紅花蕉（Musa coccinea），均采自生長發(fā)育正常的健康植株。每種材料采集3株，采集當(dāng)天返回實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存在4 ℃冰柜內(nèi)，于第2天分離樣品。

內(nèi)生細(xì)菌分離采用NA培養(yǎng)基。內(nèi)生細(xì)菌脂肪酸提取用TSBA培養(yǎng)基：3%胰蛋白胨大豆肉湯（Tryptic soy broth，TSB，購于Fisher公司）+1.5%瓊脂。脂肪酸提取處理試劑如下：

皂化試劑：氫氧化鈉45 g+甲醇150 mL+水150 mL；

甲基化試劑：6 N鹽酸325 mL+甲醇275 mL；

萃取試劑：正已烷200 mL+甲基叔丁基乙醚200 mL；

洗滌試劑：氫氧化鈉10.8 g+水900 mL（配制方法由MIDI公司提供）。

氣相色譜系統(tǒng)：美國Agilent-6890N型。

分析軟件：美國MIDI公司開發(fā)的基于微生物細(xì)胞脂肪酸成分鑒定的全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)Sherlock MIS 4.5（Microbial Identification System）和LGS 4.5（Library Generation Software）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離 每株樣品選取10個(gè)不同部位，每個(gè)部位采集3份重復(fù)。各部位材料選取依據(jù)：根部分別選取根尖、距土表30 cm左右的材料；莖部分別選取根莖交接處10 cm以內(nèi)、中段10 cm以內(nèi)、距頂端10 cm以內(nèi)的部分；地下球莖、葉柄、葉肉組織、葉主脈、葉側(cè)脈隨機(jī)選取。將樣品沖洗干凈，吸干表面水分。分別稱取不同部位植株組織，先用75%酒精浸泡數(shù)十秒，無菌水沖洗數(shù)次后，再用10%次氯酸鈉溶液浸8 min，無菌水反復(fù)漂洗，無菌濾紙吸干。并取最后一次漂洗材料后的無菌水涂布平板，然后置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)足夠天數(shù)，若無菌落出現(xiàn)，證明表面消毒徹底，分離結(jié)果可用。用無菌剪刀將樣品剪碎在無菌研缽中，充分研磨勻漿，用無菌水101、102、103、104梯度稀釋后取200 μL稀釋液涂布于NA平板上，3個(gè)重復(fù)，30 ℃暗培養(yǎng)。分離的樣品長出單菌落后，調(diào)查總菌落數(shù)，并根據(jù)菌落顏色、形狀、干濕、高度、透明度、邊緣等特征，挑取各部位具有代表性的單菌落，分別計(jì)數(shù)后用-80 ℃甘油冷凍保存。采用DPSR軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 內(nèi)生細(xì)菌的鑒定 細(xì)菌脂肪酸的提取、氣相色譜檢測和脂肪酸的鑒定方法參照陳璐[6]、藍(lán)江林等[7]發(fā)表的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 芭蕉屬植物內(nèi)生細(xì)菌種群數(shù)量的分布特性

不同種類的芭蕉屬植物內(nèi)生細(xì)菌含量差異顯著，威廉斯香蕉內(nèi)生細(xì)菌含量最高，達(dá)8.809×108 cfu/g，其次是野生蕉，達(dá)7.597×106 cfu/g，芭蕉和紅花蕉含菌量差不多，均是4個(gè)種類中最低的，分別為2.022×105 cfu/g和2.171×105 cfu/g。具體到各個(gè)部位，不同種類的芭蕉屬植物內(nèi)生細(xì)菌含量也差異顯著。葉部的內(nèi)生細(xì)菌含菌量規(guī)律為威廉斯香蕉≌野生蕉>芭蕉>紅花蕉；莖部的內(nèi)生細(xì)菌含菌量規(guī)律為威廉斯香蕉>野生蕉>芭蕉>紅花蕉；根部的內(nèi)生細(xì)菌含菌量規(guī)律為威廉斯蕉>野生蕉>芭蕉≌紅花蕉（表1、2）。

由表1、2可知，野生蕉內(nèi)生細(xì)菌不同部位的數(shù)量分布為葉部>根部>莖部，芭蕉內(nèi)生細(xì)菌不同部位的數(shù)量分布為莖部>葉部>根部，紅花蕉和威廉斯香蕉內(nèi)生細(xì)菌不同部位的數(shù)量分布均為根部>葉部≌莖部。野生蕉內(nèi)生細(xì)菌在葉部的分布主要在葉柄、葉主脈和葉側(cè)脈，莖部的分布主要在莖中部、莖基部，根部的分布在根體和根尖；芭蕉內(nèi)生細(xì)菌在葉部的分布主要在葉肉，莖部的分布主要在莖頂部，根部的分布主要在根體；紅花蕉內(nèi)生細(xì)菌在葉部和莖部分布極少，根部的分布主要在根尖；威廉斯香蕉內(nèi)生細(xì)菌在葉部的分布主要在葉柄，莖部的分布主要在莖基部，根部的分布主要在根體，根體中內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量遠(yuǎn)超過其他9個(gè)部位。

2.2 芭蕉屬植物內(nèi)生細(xì)菌的鑒定

共分離得到64株內(nèi)生細(xì)菌，其中相似性指數(shù)大于0.500，可確定其菌種名稱的有23株，14個(gè)種（表3）；相似性指數(shù)低于0.500[6]，還未能確定菌種名稱的有41株。已鑒定的14個(gè)種隸屬于11個(gè)屬，

分別是沙門氏菌屬（Salmonella spp.）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas spp.）、埃希氏菌屬（Escherichia spp.）、Paucimonas spp.、假單胞桿菌屬（Pseudomonas spp.）、腸桿菌屬（Enterobacter spp.）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella spp.）、根瘤菌屬（Rhizobium spp.）、芽孢桿菌屬（Bacillus spp.）、西地西菌屬（Cedecea spp.）、耶爾森氏菌屬（Yersinia spp.）。

2.3 內(nèi)生細(xì)菌在芭蕉屬植物中的分布特性

鑒定的內(nèi)生細(xì)菌在芭蕉屬植物內(nèi)的數(shù)量分布見表4。由表4可知，內(nèi)生細(xì)菌豬霍亂沙門菌（S. choleraesuis）、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（S. maltophilia）、P. lemoignei、產(chǎn)氣腸桿菌（E. aerogenes）只出現(xiàn)在野生蕉植株內(nèi)；放射根瘤菌（R. adiobacter）和巨大芽孢桿菌（B. megaterium）只存在于芭蕉植株內(nèi)；而惡臭假單胞桿菌（P. putida）、戴氏西地西菌（C. davisae）和弗氏耶爾森菌（Y. frederiksenii）只在威廉斯香蕉植株內(nèi)出現(xiàn)。另外，同時(shí)存在野生蕉和威廉斯香蕉里有大腸桿菌（E. coli）、傷寒沙門氏菌（S. typhi）、門多薩假單胞桿菌（P. mendocina）、克雷白氏桿菌（K. pneumoniae）；只有赫替假單胞桿菌（P. huttiensis）同時(shí)存在于野生蕉和芭蕉。紅花蕉上沒有分離到這14種內(nèi)生細(xì)菌。

其中傷寒沙門氏菌、克雷白氏桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌和赫替假單胞桿菌是野生蕉上的優(yōu)勢種群，赫替假單胞桿菌、放射根瘤菌、巨大芽孢桿菌是芭蕉上的優(yōu)勢種群，傷寒沙門氏菌是威廉斯香蕉上的優(yōu)勢種群。傷寒沙門氏菌分布于野生蕉的莖部和威廉斯香蕉的根部，同時(shí)威廉斯香蕉的含量比野生蕉高近794倍；克雷白氏桿菌分布在野生蕉和威廉斯香蕉的莖部，其中在威廉斯香蕉中的分布比野生蕉高19倍多；赫替假單胞桿菌分布在野生蕉根部和芭蕉葉部，在野生蕉體內(nèi)濃度約為芭蕉體內(nèi)的27.6倍。野生蕉植株內(nèi)的內(nèi)生細(xì)菌種類最多，有9種；其次是威廉斯香蕉，有7種；紅花蕉上最少，為0種；芭蕉上只有3種。但威廉斯香蕉上內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量最多，尤其在根部；其次是野生蕉，內(nèi)生細(xì)菌同樣集中在根部。

3 討論與結(jié)論

在對(duì)植物內(nèi)生菌研究應(yīng)用之前對(duì)其微生態(tài)學(xué)要有足夠的了解[8]。許多研究表明植物內(nèi)生菌具有宿主特異性。有報(bào)道稱發(fā)現(xiàn)茶樹有性系后代中不同品種內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量差異顯著[9]。在研究宿主植物的基因型對(duì)棉花的內(nèi)生細(xì)菌的影響中Adams等[10]認(rèn)為，宿主植物的基因型等影響內(nèi)生細(xì)菌在植株中的生存。本研究發(fā)現(xiàn)不同品種芭蕉屬植物內(nèi)生細(xì)菌含量存在較大差別，在4個(gè)檢測品種中野生蕉內(nèi)生細(xì)菌含量最高，芭蕉含菌量最低。結(jié)果證明了植物體內(nèi)內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量與品種存在一定的關(guān)系。因此，在從芭蕉屬植物內(nèi)生細(xì)菌中尋找芭蕉屬植物病害拮抗菌株時(shí)，應(yīng)選擇能夠廣泛定殖于芭蕉屬植物中的內(nèi)生細(xì)菌種群。

在同一種植物的不同器官組織中，內(nèi)生菌的數(shù)量也有所不同。付業(yè)勤等[11]報(bào)道的香蕉內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量在植株根、假莖、葉柄、葉片組織的總體分布呈現(xiàn)遞減趨勢。本文研究得到相似結(jié)果，紅花蕉和威廉斯蕉有個(gè)共同特征是根部含菌量遠(yuǎn)高于葉部和莖部。其他植物上也有相似的研究結(jié)果，如哈密瓜內(nèi)生細(xì)菌分布規(guī)律為種子>根>葉片>莖>葉柄>果實(shí)[12]。但也有辣椒葉部內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量高于根部的報(bào)道[13]。本研究中野生蕉葉部內(nèi)生細(xì)菌含量同樣比根部含量高。因此植物品種和器官都是影響內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量的因素。選擇芭蕉屬植物病害拮抗菌株時(shí)，應(yīng)研究其在不同芭蕉屬品種植株體內(nèi)的定殖規(guī)律，以便掌握該拮抗菌株的特性，更好地運(yùn)用在生物防治上。

現(xiàn)代微生物學(xué)研究表明：細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)中普遍含有的脂肪酸成分與細(xì)菌的DNA具有高度的同源性，各種細(xì)菌具有其特征性的細(xì)胞脂肪酸指紋圖譜[14]。因此它的種類和含量是細(xì)胞化分類法的重要依據(jù)之一。Sherlock MIS微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)是一種商業(yè)化的微生物脂肪酸氣相色譜分析系統(tǒng)，有一套完整的標(biāo)準(zhǔn)化程序，該系統(tǒng)備有迄今為止微生物鑒定系統(tǒng)中最大的數(shù)據(jù)庫資源，包括嗜氧菌1 100余種，厭氧菌800余種，酵母菌和放線菌約300種，共計(jì)超過2 200種[15]。本文分離到64株內(nèi)生細(xì)菌，因?yàn)槭艿皆心Ｊ骄旰蛿?shù)據(jù)庫的限制，僅23株鑒定到種級(jí)。因此利用已鑒定的23株內(nèi)生菌進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌類群的研究。其中豬霍亂沙門菌、傷寒沙門氏菌、P. lemoignei、門多薩假單胞桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、赫替假單胞桿菌、惡臭假單胞桿菌、弗氏耶爾森菌為本研究新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生細(xì)菌。

黎起秦等[16]發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌的類群因番茄品種而異，他們認(rèn)為這種差異可能與內(nèi)生細(xì)菌對(duì)宿主的選擇性相關(guān)，并且提出番茄內(nèi)生細(xì)菌與宿主植物共生關(guān)系的形成是經(jīng)過長期自然選擇的結(jié)果。本文研究的23種內(nèi)生菌中僅大腸桿菌、傷寒沙門氏菌、門多薩假單胞桿菌、克雷白氏桿菌、赫替假單胞桿菌同時(shí)存在于2種芭蕉屬植物中。黎起秦等[16]對(duì)番茄內(nèi)生細(xì)菌類群數(shù)量的研究表明，不同器官中類群數(shù)量亦有差異，在根部最多，其次是莖和葉。本研究中數(shù)量大、分離頻率高的3種優(yōu)勢菌株為傷寒沙門氏菌、克雷白氏桿菌、赫替假單胞桿菌，其中存在于根部的共有2株，為傷寒沙門氏菌和赫替假單胞桿菌；另外莖部1株，為克雷白氏桿菌。可見，芭蕉屬植物內(nèi)生細(xì)菌主要集中在根部。

本研究中赫替假單胞桿菌為4種芭蕉屬植物植株中的優(yōu)勢菌株，又能同時(shí)存在于多種芭蕉屬植物中。在黎起秦等[16]的研究中假單胞桿菌（Pseudomonas spp.）在不同番茄品種、植株的不同器官以及不同栽培地區(qū)中是主要類群。郝曉娟等[17]從香蕉植株中分離得到一株銅綠假單胞菌（P. aeruginosa），對(duì)香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）有良好的抑制作用。因此，假單胞桿菌作為生防菌定殖于芭蕉屬植物植株體內(nèi)的可行性很大。

雖然4個(gè)品種的芭蕉屬植物分別采自不同地區(qū)，但這4個(gè)地區(qū)的氣候差異不大，在本研究中不同種植地區(qū)對(duì)內(nèi)生菌種群分布影響可以忽略不計(jì)。本研究中芭蕉屬植物內(nèi)生細(xì)菌的種群分布主要與宿主品種和器官的不同有關(guān)，因此在研制和應(yīng)用內(nèi)生細(xì)菌制劑時(shí)，要充分考慮各類因素的影響，防止各類因素對(duì)制劑應(yīng)用效果的影響。

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責(zé)任編輯：葉慶亮