稻瘟病菌MoYpt5蛋白互作網絡預測

黨謝等

摘 要 稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）共有11個假定的Rab蛋白家族成員，本文選取了MoYpt51（MGG_06241）和MoYpt52（MGG_01185）進行了生物信息學分析。通過搜索多個大型蛋白互作數據庫和文獻，共得到數百個與核心蛋白互作的蛋白和互作對。利用信息處理技術和高效制圖平臺將這些蛋白互作對構建成互作網絡，得到若干個具有生物學意義的模塊。結果表明，篩選得到的互作蛋白中，有的參與了蛋白降解的泛素途徑（MGG_04053等）、囊泡介導的蛋白胞內運輸（MGG_01238等），有的在蛋白、染色體的組裝和修飾等過程（MGG_03677等）起重要作用。大部分假定互作蛋白定位于細胞質和質膜上，為其與目標蛋白互作提供了空間可能性。

關鍵詞 稻瘟病菌；MoYpt5蛋白；蛋白互作網絡

中圖分類號 Q71；Q291 文獻標識碼 A

The Prediction of Protein-protein Interaction Network

of MoYpt5 in Magnaporthe oryzae

DANG Xie， CHEN Jian*， LIAN Bi， WANG Zonghua， ZHOU Jie**

School of Life Science， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract There are 11 putative members of Rab family in Magnaporthe oryzae. MoYpt51（MGG_06241）and MoYpt52（MGG_01185）were chosen to conduct analysis of their protein interaction network by bioinformatics. We acquired hundreds of proteins and interaction-partners which interact with the core protein by searching several large protein interaction databases and references， and got a few significantly biological modules on the base of the technology of bioinformatics analysis and the platform of highly effective charting. The results showed that some（MGG_04053， etc.）of the screened proteins involve in the ubiquitin pathway of protein degradation and the protein transportation processes introduced by vesicles in cells（MGG_01238， etc.）， some（MGG_03677， etc.）play a crucial role in the assembling and modifying processes of proteins and chromosomes. Most of the interaction proteins are localized in the cytoplasm and on the cell membrane which generate a spatial possibility of interacting with targeting proteins.

Key words Magnaporthe oryzae； MoYpt5 protein； Protein-protein interaction network

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.025

稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）是研究植物病原真菌致病機理的重要模式生物。隨著水稻和稻瘟病菌基因組測序完成，人們將分子遺傳學、功能基因組學、蛋白質組學和生物信息學等方法相結合對水稻和稻瘟病菌之間的互作關系進行更加深入的探索，希望從分子生物學水平上開辟一條新的防治道路[1]。

在哺乳動物細胞中，Rab5蛋白至少存在著Rab5a、Rab5b和Rab5c 3種形式[2]，釀酒酵母中Rab5（Ypt5）有3個同源蛋白：Ypt51（Vps21）、Ypt52和Ypt53[3]。Rab5不僅參與細胞內的物質運輸和蛋白分選，而且還參與信號轉導與細胞骨架的構建[4-5]，在篩選小鼠巨噬細胞cDNA文庫時，Rab5參與并增強了凋亡細胞被吞噬的過程[6]。Ypt5在胞吞作用過程中起著關鍵作用，能夠調節膜泡的融合、囊泡的運輸以及內涵體的形成[7-9]。此外，Ypt5還參與酵母的有性交配過程和細胞形態建成，其功能的異常會導致酵母對鈣離子和鉀離子更加敏感[10]。

和其他小G蛋白一樣，Rab蛋白的功能主要是通過其上游的調節蛋白和下游的效應蛋白實現的，因此，尋找Rab蛋白的互作蛋白才能深入地了解Rab蛋白的生物學功能。本文利用酵母中Ypt51和Ypt52的氨基酸序列在稻瘟病菌數據庫中進行同源搜索，得到同源性較高的MoYpt51（MGG_06241）和MoYpt52（MGG_01185），建立了稻瘟病菌MoYpt5的蛋白互作網絡，為篩選病原菌中相互作用蛋白提供一種可借鑒的手段。

1 材料與方法

1.1 所用數據庫和生物信息學軟件

MPID（稻瘟病菌蛋白互作數據庫[11]，Http：//bioinformatics.cau.edu.cn/cgi-binzzd-cgi/ppi/mpid.pl）；SGD（釀酒酵母基因組數據庫，Http：//www.yeastgenome.org/）BioGRID（生物通用相互作用數據庫集[12]），Http：//thebiogrid.org/）；IMEx（國際分子相互作用交換聯盟，Http：//www.imexconsortium.org/）；Cytoscape軟件。

1.2 生物信息學分析方法

1.2.1 進化分析 以稻瘟病菌MoYpt51（MGG_06241）和MoYpt52（MGG_01185）為靶蛋白在NCBI（Http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和稻瘟病菌數據庫（Http：//www.broadinst—itute.org/annotation/genome/magnaporthe_

comparative/MultiHome.html）中進行BLASTP搜索，E值設為1e-6，并通過保守結構域分析（Http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi.）從而獲得這些蛋白在動物、植物以及微生物中的同源蛋白序列。在獲得稻瘟病菌Ypt5蛋白同源序列的基礎上，使用ClutsalX1.83軟件進行多重比對，形成序列多重比對結構圖，結合MEGA4.0建立稻瘟病菌MoYpt51和MoYpt52與其他生物同源蛋白間的系統進化樹。

1.2.2 蛋白互作網絡的建立 利用Cytoscape軟件及其插件得到預測網絡的分割模塊，再通過文獻和代謝通路數據庫對模塊的生物學意義和功能進行深入分析，同時，對PPI進行拓撲結構分析，包括網絡基本參數、度分布、最短通徑、壓力向心力和聚類系數等，從而評估數據的可信度和穩定性[13]。

1.2.3 互作蛋白的亞細胞定位分析 本實驗使用的細胞內定位預測軟件是CELLO（Subcellular localization predictive system），此軟件適用于大部分的真核生物，對真菌的預測準確度比較高，主要是依據蛋白序列結構上的特異性，是多種算法和計算軟件的集合。

1.2.4 結構域搜索和互作驗證 利用Pfam（Protein families database）和iPfam（interaction Pfam）數據庫進行分析。數據庫[14]（Http：//pfam.sanger.ac.uk）是以序列多重比對和隱馬爾可夫模型為基礎蛋白家族和結構域的大型綜合數據庫；iPfam（interaction Pfam）數據庫是Pfam數據庫的蛋白互作子數據庫，它描述在PDB中收錄的已觀測到的DDI（Domain-Domain Interaction）。以PDB中儲存的多結構域蛋白和蛋白復合物為基礎，計算結構上足夠接近并能形成相互作用的殘基之間的距離和識別原子間鍵之范德華力、氫鍵、鹽橋和二硫鍵等的相互作用[15]。然后將先前預測得到的稻瘟病菌Ypt5蛋白互作對的序列信息輸入Pfam數據庫中進行蛋白結構域的查找和互作分析，從而進一步對蛋白互作網絡進行驗證。

2 結果與分析

2.1 MoYpt51和MoYpt52進化分析

以稻瘟病菌MoYpt51（MGG_06241）為靶蛋白在NCBI和稻瘟病菌數據庫進行同源蛋白搜索和BLASTP比對分析，獲得這些蛋白在動物、植物以及微生物中的同源蛋白序列17個（圖1-A），并從中挑選6個具有典型意義的稻瘟病菌Ypt5蛋白同源序列，分別為：NcYpt51（XP_964811.1）、AkYpt51（GAA82723.1）、SpYpt51（NP_593907.1）、HsRab5（NP_002859.1）、RnRab5（NP_001099310.2）、ScYpt51（NP_012939.1）。使用Clustal X 1.83軟件形成序列多重比對結構圖（圖1-B）。

用同樣方法，共找到稻瘟病菌MoYpt52（MGG_01185）同源蛋白14個（圖2-A），并從中挑選6個具有典型意義的稻瘟病菌Ypt52蛋白同源序列，分別為：NcYpt52（XP_955952.1）、AcYpt52（XP_001271078.1）、ScYpt52（NP_014732.1）、HsRab5a（NP_004153.2）、MmRab5a（NP_080163.1）、AtRab5a（NP_193699.1），進行了多重比對分析（圖2-B）。

從以上2個蛋白的系統進化樹可以看出，MoYpt51和MoYpt52與粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisia）的遺傳距離較近，同源性高。由于在真菌領域對粗糙脈孢菌研究相對來說不夠深入，數據庫的知識量偏少，所以在下面基于同源映射搜索蛋白互作對的過程中，主要選取釀酒酵母作為模式真菌。氨基酸序列比對表明MoYpt51和MoYpt52都具有G結構域和可變的N端和C端組成。G結構域中具有5個高度保守的氨基酸序列RabF1-F5，可作為Rab蛋白鑒定的特征序列，4個保守序列RabSF1-4可作為區分Rab蛋白亞家族的特征序列。這說明Rab家族蛋白的功能結構域是十分保守的，這為基于蛋白結構域上的互作驗證準確性奠定了基礎。

2.2 MoYpt51和MoYpt52的假定互作蛋白

從MPID數據庫中共得到MoYpt51（MGG_06241）的假定互作蛋白8個，SGD數據庫6個，BioGrid互作數據庫27個，IMEX蛋白互作綜合數據庫3個（表1）。

從MPID數據庫中共得到MoYpt52（MGG_01185）的假定互作蛋白共1個，SGD數據庫5個，BioGrid互作數據庫10個，IMEX蛋白互作綜合數據庫1個（表2）。

通過4個大型蛋白互作數據搜索，得到了上百個與核心蛋白互作的一級和二級互作蛋白（二級蛋白較多未列出），結合數個文獻數據的支持，表明這些互作蛋白之間有某些化學或者是物理學之間的互作關系。

2.3 MoYpt51和MoYpt52的蛋白互作網絡和亞細胞定位

進一步，本研究建立了MoYpt51（MGG_06241）蛋白互作網絡圖（圖3-A），該網絡共涉及到248個蛋白，652個互作蛋白對，其中與核心蛋白MoYpt51互作的一級蛋白共39個，其余為二級互作蛋白208個。

圖3-B是從圖3-A剝離出來的互作網絡子圖，此子圖中只有核心蛋白和直接與核心蛋白互作的一級蛋白，并使用CELLO數據庫對這些互作蛋白進行了亞細胞定位分析。MoYpt51蛋白主要定位在細胞質[16]，所以位于細胞質和質膜上的蛋白與其互作的概率較大，這樣的蛋白共有19個，占一級互作蛋白總數的48.7%。

MoYpt52（MGG_01185）互作網絡圖（圖4-A）共涉及到144個蛋白，352個互作蛋白對。其中與核心蛋白MoYpt52互作的蛋白共17個，其余為二級互作蛋白126個。

亞細胞定位預測結果表明，MoYpt52蛋白定位于細胞質（圖4-B），這類蛋白共有10個，占一級互作蛋白總數的58.8%，MoYpt52蛋白互作網絡里有50%以上的假定互作蛋白在亞細胞定位上與MoYpt52蛋白有空間上的互作關聯。

2.4 MoYpt51和MoYpt52蛋白互作網絡的模塊聚類分析

對MoYpt51蛋白互作網絡進行模塊分割，共得到6個聚類模塊（圖5A-F），通過代謝通路和文獻分析，模塊A和B中的核心蛋白MGG_04053和MGG_07727以及關聯蛋白MGG_00908、MGG_03512、MGG_07031和MGG_00170等都是蛋白泛素降解途徑的重要蛋白；模塊C中的核心蛋白MGG_01238以及關聯蛋白MGG_05256和MGG_03283與囊泡介導的蛋白胞內運輸有關；模塊D中的核心蛋白MGG_06343和它的互作蛋白MGG_01652、MGG_00904和MGG_07931參與了胞內蛋白的折疊過程；模塊E中的4個蛋白參與了蛋白磷酸化過程，該模塊可能是胞內信號轉導途徑的部分；F模塊含有內涵體向高爾基體逆向運輸的調節蛋白MGG_08645，而MGG_04143也是轉運相關蛋白，初步推測該模塊是細胞內吞過程的下游代謝模塊之一。

對MoYpt52蛋白互作網絡進行分割共得到5個模塊（圖6A～E），模塊A的核心蛋白MGG_02608以及相關蛋白MGG_00908、MGG_01380和MGG_

07031等眾多蛋白都參與了蛋白泛素降解途徑，這是從主網絡中分離的較為完整的蛋白代謝模塊；模塊B中的核心蛋白MGG_01238以及關聯蛋白MGG_

05256和MGG_03283與囊泡介導的蛋白胞內運輸有關，推測其為蛋白胞內轉運的代謝模塊之一；模塊C中的核心蛋白MGG_06910以及樞紐蛋白MGG_09346與胞內蛋白從內質網向高爾基體轉運過程有關，這是一個胞內蛋白運輸代謝模塊之一；模塊D中的關聯蛋白MGG_04389和MGG_04978預測是內吞過程中蛋白錨定功能模塊；模塊E中核心蛋白MGG_03677具有乙酰轉移酶活性，而其他幾個關聯蛋白與染色體的組裝有關，該模塊可能參與了染色體的組裝和修飾。

2.5 結構域搜索和互作驗證

將互作蛋白的序列數據輸入到Pfam數據庫中（Http：//pfam.sanger.ac.uk/）得到結構域信息和PfamIDs。在此基礎上利用IPfam和3DID（Http：//3did.irbbarcelona.org/domainquery.html）等結構域互作數據庫來驗證這些蛋白的互作關系。結果表明（表3、4），MoYpt51結構域互作蛋白有7個，MoYpt52結構域互作蛋白有5個，所有這些用結構域互作篩選到的蛋白都在先前篩選的互作蛋白庫內，這也就說明了研究數據的可信性。

3 討論與結論

3.1 MoYpt51和MoYpt52蛋白互作網絡特性分析

本文篩選的預測蛋白都是通過生物信息學同源映射方法而來，其數據量較大，具有廣闊的篩選空間和一定的可信度。從網絡的拓撲特性上看，這些互作網絡與隨機網絡相比具有明顯無尺度網絡特征和小世界屬性，蛋白間聯系較為緊密，有一定的模塊聚類特點。利用結構域數據庫分析驗證了部分具有較高互作可能性的蛋白，這些蛋白都有著若干個與Ras家族的特定保守結構域G1-G5以及Rab家族的特定基序RabF1-4相互作的特定功能結構域，進一步說明了這些蛋白和MoYpt5互作的可能性。

3.2 MoYpt51和MoYpt52蛋白互作網絡的驗證

酵母相關研究表明，CORVET復合物是酵母中Ypt5的效應子，而Vps8是CORVET的一個重要亞基[3，17]，主要參與囊泡的胞內運輸過程，經酵母Vps8同源比對得到稻瘟病菌中的MGG_01238。Vps9是Ypt51（Vps21）的上游調節蛋白鳥苷酸交換因子GEF，對Vps21的活性起著至關重要的作用[19]，同源比對可以得到稻瘟病菌中的MGG_05379。鳥苷酸解離因子（GDI）負責將細胞之中GDP結合態的Rab蛋白運輸到質膜上面，對Ypt51的功能循環起著重要的調節作用[20]，稻瘟病菌中的同源蛋白為MGG_07137。這些研究與本文的部分結果十分契合，進一步說明了本文預測的互作蛋白可信度。

3.3 MoYpt51和MoYpt52蛋白互作網絡預測的意義

目前，Rab5/Ypt5多在酵母和人類中進行了相關的功能研究，但至今還未見到稻瘟病菌中對此類蛋白的報道。本文分別對稻瘟病菌MoYpt51和MoYpt52的蛋白互作網絡進行了相關的預測，得到了大量的數據，包括與MoYpt5互作的蛋白和相關蛋白的亞細胞定位，這些結果和人類以及酵母的Rab5/Ypt5在胞吞、囊泡融合等功能上是相對應的，為研究MoYpt51和MoYpt52的功能關系、其下游效應子的鑒定以及MoYpt5的體內互作分子網絡提供了可行性依據，為稻瘟病菌的致病機制以及稻瘟病的防治奠定了理論基礎。

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責任編輯：葉慶亮