三明野生蕉Whirly轉錄因子的克隆及其在低溫脅迫下的定量表達分析

楊洋等

摘 要 以三明野生蕉葉片為材料，通過克隆獲得Whirly基因的ORF，并研究Whirly基因在不同溫度處理下的轉錄水平。結果表明：采用PT-PCR結合RACE技術，克隆得到三明野生蕉Whirly基因，其在GenBank的登錄號為KC127691。Whirly的開放閱讀框為738 bp，編碼245個氨基酸。生物信息學分析顯示，Whirly蛋白屬于親水蛋白，不具有信號肽，二級結構由α螺旋、β折疊和無規則卷曲組成，保守結構域預測顯示該基因屬于植物Whirly轉錄因子基因家族。實時熒光定量PCR分析顯示，Whirly轉錄因子在不同低溫脅迫下表達水平有較大差異，隨著溫度的降低，相對表達量呈“M”型變化模式，在20 ℃和4 ℃時達到較高的轉錄水平，結合前人研究結果可知，三明野生蕉Whirly轉錄因子可能參與了包括抗寒等多個抗逆途徑的調控。

關鍵詞 三明野生蕉；Whirly；基因克隆；生物信息學；熒光定量PCR

中圖分類號 Q943.2 文獻標識碼 A

Cloning and Expression Under Low Temperature Conditions

of Whirly Transcription Factor in a Wild Banana

Accession（Musa spp.）from Sanming City

YANG Yang，LAI Gongti，LAI Zhongxiong*

Institute of Horticultural Biotechnology，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China

Abstract In the paper， the open reading frame（ORF）of Whirly gene was cloned from a Sanming wild banana accession（Musa spp.）. The expression level of Whirly was studied under different temperature conditions. Whirly of Sanming wild banana was cloned by RT-PCR and the accession number was KC127691 in GenBank. Whirly contains a 755-nucleotides-long open reading frame（ORF），encoding a polypeptide of 245 amino acids. Bioinformatics analysis showed that the protein was hydrophilic and without signal peptide. Whirly belongs to plant whirly transcription factors. The secondary structure was made of the alpha helix，beta sheet and coil. Real-time quantitative PCR results indicated that the expression level of Whirly transcription factor is quite different under different low temperature stress. With the temperature decreasing，the relative quantitative expression patten presented as “M”-type. The expression of Whirly peaked at the treatment of 20 ℃，and maintained a high levels at 4 ℃. Combining with previous studies，we predicted that whirly transcription factors may play an important role in many kinds of resistance response including cold-resistance.

Key words Sanming wild banana；Whirly；Gene cloning；Bioinformatics；QPCR

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.015

芭蕉科（Musaceac）芭蕉屬（Musa）的香蕉（Musa spp.）是多年生大型草本單子葉植物，其產量僅次于柑桔類水果，在世界水果生產中占有十分重要的地位[1]。中國香蕉在華南地區種植廣泛，其生長對溫度要求較高， 寒害嚴重影響香蕉的生長，使其產量大大降低[2]。福建省野生香蕉種質資源幾乎覆蓋所有地市，對三明、福州[3-5]等地的野生蕉研究已有詳細報道。其中三明野生蕉耐寒性比較強，能夠耐-5 ℃以下的低溫[6]，可從中分離抗性目的基因資源，從而用于香蕉的抗性基因工程育種[7]。

Whirly（WHY）屬于轉錄因子，Desveaux等[8]從土豆中分離出來的核轉錄因子PBF-2（PR-10a binding factor2），是第一個Whirly家族成員。隨后Krause等[9]、Marechal等[10]又在擬南芥、土豆中發現其他成員，但目前尚未有香蕉Whirly克隆的相關報道。有研究發現，Whirly能與DNA以單鏈形式結合并調控抗性基因的表達，Whirly蛋白可與ERE元件[8，11]、端粒重復序列結合[12]，Xiong等[13]亦發現Whirly蛋白可與擬南芥AtKP1的上游元件結合。Despres等[14]發現StWhy1能特異地與ERE元件結合并誘導PR-10a基因的表達，而PR（pathogenesis-related protein）基因是可以被病原入侵激活表達的基因[15-16]，Whirly的抗病響應亦可是水楊酸-依賴的抗病反應[11]，RNA干擾技術可使水稻OsWhirly基因沉默并導致超敏反應（Hypersensitiveresponse，HR）增強[17]。Whirly轉錄因子參與多個抗逆途徑，在抗病、抗衰老等多種生物抗性反應中發揮著重要的作用。有研究發現Whirly蛋白不僅在防御進程中發揮作用，在葉綠體和細胞核中也能起到一定的作用[18]。所以，研究Whirly轉錄因子具有重要的意義。三明野生蕉抗性較強，從三明野生蕉中分離Whirly基因對香蕉的抗性育種意義重大。本研究是在香蕉基因組的基礎上，進一步克隆獲得三明野生香蕉（Musa spp.）Whirly基因，采用生物信息學和熒光定量PCR方法對其進行初步的功能分析，深入研究Whirly轉錄因子在香蕉對低溫脅迫的應答機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

三明野生蕉試管苗由本研究所提供，常溫下培養三明野生蕉試管苗，將從中所提取的RNA經相應的反轉錄后用于Whirly基因克隆；試管苗分別經28、20、13、4、0 ℃處理36 h后，提取總RNA進行cDNA合成，用于熒光定量PCR（qPCR）分析，其中28 ℃處理為對照。

1.2 方法

1.2.1 三明野生蕉試管苗總RNA提取和cDNA合成 三明野生蕉葉片總RNA的提取按照北京天恩澤基因有限公司的柱式植物RNA out 2.0（Column Plant RNAout 2.0）試劑盒說明書進行。采用瓊脂糖凝膠電泳和核酸定量儀對所提取的總RNA進行質量和濃度檢測。以提取的RNA為模板，使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fementas）試劑盒，按照操作說明進行cDNA合成。

1.2.2 三明野生蕉Whirly基因ORF的克隆 參照小果野生蕉基因組（http：//banana-genome.cirad.fr/）已知Whirly序列，以三明野生香蕉葉片第一鏈cDNA為模板，利用DNAMAN 6.0軟件設計的上下游引物分別為Whirly-F1（CCTGCAACGATGAGAAG

AACCT）和Whirly-R1（GCTCTGATTTACCTTCCCCA

CT），用于克隆三明野生蕉Whirly基因的開放閱讀框（ORF）。PCR反應結束后，將獲得的PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，割取目的片段進行回收，連接于pMD 18-T載體上，最后委托鉑尚生物技術有限公司進行測序。

1.2.3 三明野生蕉Whirly基因生物信息學分析 采用NCBI在線BLAST比對基因cDNA序列及其推導的蛋白序列同源性。應用在線蛋白分析軟件ExPASy ProtParam、ProtScale、ScanProsite、SWISS-MODEL、InterProScan、NCBI-ProteinTools的CDD及在線PSIPRED對所獲基因推導的氨基酸序列進行分析，并利用MEGA5.0軟件構建系統進化樹。

1.2.4 低溫脅迫下三明野生蕉Whirly定量表達分析 三明野生蕉在低溫脅迫下的定量表達分析按照TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit（Perfect Real Time，TaKaRa）試劑盒的步驟，先進行反轉錄合成定量所需的cDNA。分別以28、20、13、4、0 ℃處理過的三明野生蕉試管苗cDNA為模板，采用熒光定量PCR技術對其進行定量表達分析。用于Whirly定量表達分析的上下游引物分別為Whirly-F2（5′-GCTTCCTCTCATGCAGCTCT-3′）和Whirly-R2（5′-TGGTGACACTGACAAGGCAG-3′）。PCR反應體系按照操作說明進行。每個反應設置3個重復。采用相對定量法[19]，以18S rRNA為內參基因，擴增引物為18S rRNA-F（CCTGAGAAACGGCTACCACAT）

和18S rRNA-R（CACCAGACTTGCCCTCCA），對目的基因的轉錄水平進行分析。

2 結果與分析

2.1 三明野生蕉Whirly基因ORF的克隆

以三明野生香蕉cDNA為模板，經PCR擴增獲得700 bp左右的亮帶，與設計的目的片段大小一致。經膠回收、純化，以pMD l8-T為載體對回收片段進行TA克隆。取陽性克隆測序，測序獲得755 bp片段，包含上下游引物序列。經序列比對分析可知，該片段與香蕉基因組Whirly及已登錄GenBank的其他植物Whirly基因同源性較高，可認為是野生香蕉Whirly基因。克隆獲得三明野生蕉Whirly基因ORF為738 bp，編碼245個氨基酸（圖1），其在GenBank中的登錄號為KC127691。

2.2 三明野生蕉Whirly蛋白質基本理化性質及保守結構域分析

在線軟件分析結果如下，Whirly蛋白分子量為27 012.7 u，理論等電點為9.68，屬于堿性蛋白，預測結果還顯示該蛋白是一個不穩定蛋白，不穩定系數為58.85，脂肪系數為74.37，總平均疏水指數（GRAVY）為-0.347，表明它是一個親水蛋白，經ProtScale預測的結果與上述結果一致。利用NCBI-Protein Tools的CDD在線軟件分析三明野生蕉Whirly的保守結構域（圖2），由預測結果可知Whirly基因屬于植物Whirly轉錄因子。

2.3 三明野生蕉Whirly蛋白質信號肽和亞細胞定位預測分析

用SignaIP4.1 Server對三明野生蕉Whirly進行信號肽的預測和分析，結果表明，其C、Y、S 值均小于0.5，由此預測三明野生蕉不具有信號肽，不屬于分泌蛋白。亞細胞定位預測結果表明，三明野生蕉Whirly蛋白位于線粒體基質的可能性最大，還有部分位于線粒體內膜、線粒體膜間隙及線粒體外膜。這與SignalP 4.0程序對其進行信號肽的預測結果一致。因此可以推測該蛋白是在細胞膜或細胞內行使其功能。

2.4 三明野生蕉Whirly蛋白二級結構和三維結構預測分析

對三明野生蕉Whirly蛋白二級結構的預測表明，Whirly蛋白的結構由α螺旋、β折疊和無規則卷曲組成。無規則卷曲所占比例最大，α螺旋所占比例最小。用SWISS-MODEL在線工具對野生蕉試管苗Whirly氨基酸序列進行蛋白質三維結構預測，圖3顯示了三明野生蕉Whirly蛋白是由α螺旋、β折疊片、β轉角等成分組成的三維結構。

2.5 三明野生蕉Whirly與其他植物Whirly蛋白的同源性和分子系統進化分析

將Whirly氨基酸序列進行NCBI-BLAST比對分析，結果發現該序列與短柄草Why2、玉米Why2、水稻Why2、高粱Why2、擬南芥Why2、蘋果Why、馬鈴薯Why2、葡萄Why2、可可Why2等的相似性較高，分別為56%、54%、53%、52%、46%、45%、45%、43%、42%。采用MEGA5.0軟件構建三明野生蕉Whirly的系統進化樹（圖4），發現三明野生蕉Whirly與單子葉禾本科植物的高粱、玉米、水稻和短柄草Whirly2的親緣關系比較近，而與雙子葉十字花科的擬南芥等植物的Whirly1親緣關系較遠。

2.6 Whirly基因在低溫脅迫下的定量表達分析

待三明野生蕉Whirly和內參基因qPCR反應結束后進行擴增曲線和溶解曲線分析。結果表明，Whirly引物和18SrRNA引物特異性好，標準曲線符合試驗要求。Whirly基因在不同溫度下的轉錄水平見圖5，三明野生香蕉相對表達量呈“M”型變化模式，以28 ℃處理為對照，當溫度下降到20 ℃處理36 h時，Whirly基因表達量上調至對照組的8.16倍，達到峰值；當處理溫度為13 ℃時，Whirly基因表達量為對照的3.13倍；當處理溫度為4 ℃時，Whirly基因的表達量再次上升，維持在較高的水平，為對照的5.62倍；當溫度為0 ℃時，Whirly基因的表達量下降至對照的4.52倍。綜上可知，當溫度為20 ℃和4 ℃時，Whirly具有2次轉錄高峰，因此Whirly轉錄因子在這2次高峰中可能參與了不同的轉錄調控途徑。

3 討論與結論

3.1 三明野生蕉Whirly蛋白結構的特異性

Whirly蛋白是植物特有的高度保守的家族蛋白。本研究對三明野生蕉Whirly蛋白進行生物信息學分析發現，Whirly蛋白不具有信號肽，不屬于分泌蛋白，而有研究發現擬南芥的3個Whirly蛋白都有葉綠體或線粒體信號肽[20]，因此，三明野生蕉Whirly蛋白具有獨特結構。亞細胞定位預測結果表明，三明野生蕉Whirly蛋白位于線粒體基質的可能性最大，還有部分位于線粒體內膜、線粒體膜間隙及線粒體外膜，這與孔凡英等[21]預測的結果基本一致，在質體內含量較豐富的Whirly蛋白屬于堿性蛋白，其中Ser、Leu、Pro所占比重較大。二級結構中無規則卷曲所占比例最大，α螺旋所占比例最小。三維結構預測顯示，Whirly蛋白表面有一個中心空穴并形成帶電的內腔，與已有研究相符。進化樹分析發現，Whirly蛋白與單子葉禾本科植物的親緣關系比較近，因此三明野生蕉Whirly蛋白具有與其他單子葉禾本科植物相似的生物學功能。

3.2 三明野生蕉Whirly可能參與多個抗逆途徑

研究表明，Whirly參與多個抗逆途徑，在多種生物抗性反應中發揮重要的作用Despres等[14]發現StWhy1具有誘導PR-10a基因表達的作用，而PR基因是可以被病原入侵激活表達的基因[15-16]。Desveaux等[11]發現AtWhy1在與水楊酸反應時會被激活并參與水楊酸-依賴的抗病反應，AtWhy1單鏈結合蛋白表達受水楊酸分子影響[22-23]。目前發現的抗病相關的Whirly基因家族成員有ssi1、ssi2、cpr5、cpr6和hrl1[24-27]。由此可見，Whirly參與了植物抗病響應途徑。Krause[9]等發現在大麥嫩葉中，Whirly1蛋白定位在質體，但在衰老葉片中則定位在核內，而Wingler[28] 研究發現，AtWhy2基因的敲除突變體能夠延遲衰老，表明Whirly轉錄因子在衰老調控中也起重要作用。本試驗通過生物信息學預測和定量表達分析，發現Whirly在不同溫度處理下出現2次表達高峰，分別是20 ℃和4 ℃，可見Whirly基因參與了三明野生蕉的低溫響應，在抗寒相關基因的轉錄過程中發揮著重要的作用。結合前人的研究結果推測，Whirly可能參與了包括抗寒在內的多種抗逆途徑的轉錄調控過程，因此研究Whirly轉錄因子有著廣泛而深遠的意義。

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責任編輯：林海妹