櫻桃番茄種質資源親緣關系的InDel和SSR標記分析

郭爽等

摘 要 選用18對InDel引物和15對SSR引物對30份櫻桃番茄高代自交系育種材料進行遺傳多樣性分析。多態性分析結果表明，InDel標記比SSR標記的多態性低；遺傳距離分析結果表明，30份櫻桃番茄種質材料兩兩間的遺傳距離（GD）在0.052～0.993之間，平均遺傳距離僅為0.391，遺傳距離小于0.5的種質材料占到了77.24%。在相似系數為0.65的水平上，可將30份櫻桃番茄材料分為3類。

關鍵詞 櫻桃番茄；親緣關系；InDel標記；SSR標記

中圖分類號 S641.2 文獻標識碼 A

Phylogenetic Relationship Analysis of Cherry Tomato

Germplasm Using InDel And SSR Markers

GUO Shuang， ZHANG Suping， QIU Manyu， LIU Yuping， WU Bei

Guangzhou Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou， Guangdong 510308， China

Abstract Eighteen InDel and 25 SSR primers were used to study the genetic diversity among 30 cherry tomato germplasm resources. The result of polymorphism analysis indicated that InDel markers showed lower polymorphisms than SSR markers. The genetic distance of 30 cherry tomato materials was 0.052～0.993. The average genetic distance was 0.391. Germplasm materials with genetic distance less than 0.5 accounted for 77.24%. The result of cluster analysis showed that 30 cherry tomato germplasm resources could be classified into 3 groups.

Key words Cherry tomato； Phylogenetic relationship； SSR markers； InDel markers

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.002

櫻桃番茄（Lycopersicon esculentum Mill. var. cerasiforme Alef.）又名小西紅柿、圣女果，為茄科番茄屬一年生草本植物，是一種水果型蔬菜，集水果、蔬菜、觀賞于一體，深受廣大消費者青睞。目前櫻桃番茄生產中，國外品種占據我國主要市場，因此加強擁有自主知識產權、能參與國際市場競爭的櫻桃番茄新品種的選育具有重大意義。遺傳多樣性是作物育種與改良的重要基礎。但櫻桃番茄是一種嚴格的自花授粉植物，在長期的育種實踐中，櫻桃番茄的遺傳背景逐漸變窄。因此，豐富的種質資源對櫻桃番茄新品種的選育極其重要。

隨著番茄基因組序列的公開，基于全基因組重測序的InDel標記，因其具有在基因組內分布廣、密度高、變異穩定、多態性強、檢測容易等優點，受到越來越多關注。目前基于全基因組的InDel標記在水稻[1]、玉米[2]、番茄[3]、黃瓜[4]等作物中已有應用，但在櫻桃番茄作物上的應用尚無報道。

本研究通過分析InDel標記和SSR標記在30份櫻桃番茄種質資源中的多態性，探索InDel標記在櫻桃番茄分子育種中的應用潛力。同時通過對現有的高代自交系材料進行聚類分析，明確供試材料間的遺傳距離，旨在為櫻桃番茄利用雜交優勢進行品種選育和改良育種提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗共選擇了30份櫻桃番茄育種材料（表1），均是廣州市農科院多年收集并分離自交純化的高代自交系材料。其中27份為無限生長類型，3份為自封頂類型。櫻桃番茄果形涉及圓形、高圓形、長圓形、梨形等；果色有紅色、綠色、黃色、淺黃等。2012年8月4日播種于廣州市農科院花都實驗基地，9月1日定植，待幼苗長至6～7片真葉時，混株取3～4片嫩葉于2 mL離心管中，-20 ℃保存，以備提取DNA。

1.2 試驗方法

利用15對SSR引物和18對InDel特異引物對櫻桃番茄種質材料進行遺傳多樣性分析。引物序列由中國農業大學蔬菜學系楊文才教授提供，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.1 DNA提取 采用改良的CTAB法[5]提取櫻桃番茄總DNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA條帶的完整性，UV9100B型紫外可見分光光度計測定吸光度值，檢測純度和濃度，并將其稀釋為20 ng/μL，-20 ℃下保存備用。

1.2.2 PCR擴增 擴增反應在Thermo PX2 PCR儀上進行，反應體系25 μL，包括2.5 μL 10×PCR buffer、1.6 mmol/L MgCl2 1.5 μL、0.2 μmol/L dNTPs 2 μL、0.36 μmol/L 引物正反向各1 μL、2.5 U Taq酶0.2 μL、20 ng/μL模板DNA 1 μL、ddH2O 15.8 μL。PCR的反應過程為：94 ℃預變性3 min，然后為94 ℃變性1 min，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，40個循環，最后72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物在質量分數6%變性聚丙稀酰胺膠上電泳，銀染檢測。

1.3 數據分析

在擴增產物電泳圖譜中的同一遷移位置上按條帶有無分別賦值，有擴增條帶的標記為1，無擴增條帶的標記為0，得到各樣品帶型分布表。

根據公式PICi=1-Pij2來計算引物的多態性信息含量（Polymorphism information content，PIC），公式中，Pij表示標記i的第j個帶型出現的頻率，標記i的總帶型從1到n。

采用NTSYS pc-2.10軟件進行聚類分析。對原始矩陣用Similarity程序中的Genetic distance計算樣本間的遺傳距離，并獲得遺傳距離矩陣。用Clustering程序中的SAHN程序進行聚類分析，并通過Graphics程序中的Tree plot模塊生成聚類圖。

2 結果與分析

2.1 SSR標記分析

15對SSR引物對30份櫻桃番茄種質材料的分子標記鑒定結果表明（表2），共有13對引物可以在櫻桃番茄種質材料上擴增出條帶，其中11對引物具有比較清晰的多態性條帶，產生多態性擴增的引物比率為84.6%。13對引物共擴增出52條帶，多態性帶42條，占總條帶數的80.77%，擴增片段大小在100～1 000 bp之間。平均每對引物可擴增出4條帶，其中擴增條帶最多的引物為SSR13，共6條帶；擴增條帶最少的為SSR32和SSR43，僅有2條帶。各引物多態性信息含量（PIC）分布在0.66～0.92之間，平均為0.68。引物SSR13的PIC值最大，為0.92，這對引物在本試驗的樣本群體中具有較好的多態性。

2.2 InDel標記分析

從18對InDel引物中挑選出12對在30份櫻桃番茄材料都能產生清晰條帶的引物（表3）。這12對引物共擴增出38條帶，其中多態性條帶22條，占總條帶數的57.9%。平均每對引物可擴增出3.2條帶，提供1.8個多態性位點。這12對引物擴增到的等位基因數在2～5之間，其中擴增條帶最多的引物為SL20210i，共5條帶，提供4個多態性位點。平均每個引物對產生的多態性條帶比率（PPB）為52.5%。各引物多態性信息含量（PIC）分布在0.52～0.87之間，平均為0.52。與SSR標記的平均多態性信息含量（PIC）相比，InDel標記的多態性水平較SSR標記的多態性低。

2.3 基于SSR和InDel標記的遺傳距離分析

遺傳距離是衡量樣品間相似程度的度量，遺傳距離數值越大表明材料間的差異越明顯[6]。30份櫻桃番茄種質材料兩兩間的遺傳距離（GD）在0.052～0.993之間，平均遺傳距離為0.391。編號12與編號13 2份材料之間的遺傳距離最小，僅為0.052，因為這2份材料是從同一株系分離出的姐妹系，盡管在果實大小方面存在一定差異，但是從分子水平檢測，兩者的遺傳背景還是較相近的，推測這2份材料外觀水平上的差異可能是由于環境因素造成的；編號3與編號17 2份材料之間的遺傳距離最大，為0.993，這2份材料從外觀上看，在果色和果實大小上就存在較大差異。總體來看，30份櫻桃番茄種質材料兩兩間的遺傳距離呈偏態分布（圖1），遺傳距離小于0.5的種質材料組合占到了77.24%，表明現有櫻桃番茄種質材料的遺傳背景較狹窄。兩兩間遺傳距離大于0.7的種質材料共有16對，表明這些材料間的遺傳差異較大，親緣關系較遠，可以據此指導田間的育種實踐，為田間親本材料的選擇和選配提供科學依據。

2.4 基于SSR和InDel標記的聚類分析

30份櫻桃番茄材料相似系數的變異范圍在0.345～0.948之間（圖2），平均為0.681。編號12與編號13的2份材料間相似系數最高，為0.948，與遺傳距離計算結果相同。在相似系數為0.65的水平上，可將30份櫻桃番茄材料分為三類，第一類共有12份材料，包括11份無限生長型和1份自封頂型材料；第二類共16份材料，包括14份無限生長型和2份自封頂型材料；第三類共有2份材料，均為無限生長類型。在育種實踐中，可以考慮有目的地將不同類群間的種質材料配制雜交組合，一方面篩選優良組合，另一方面可以將某些優質組合繼續自交純化，創制新種質，盡可能擴大和豐富櫻桃番茄的遺傳背景。

3 討論與結論

DNA分子標記技術的發展，為種質資源親緣關系的研究和育種效率的提高提供了新的思路和途徑。姚祝平等[7]利用AFLP分子標記對44份番茄材料進行了遺傳多樣性和親緣關系分析，從64對引物組合中篩選出15對用于擴增，共獲得364條多態性條帶，將44份番茄材料分成5個復合組和1個獨立組。本課題組在番茄遺傳多樣性的研究中，選用了育種實踐中用于配制雜交雜組合的20份高代純系番茄育種材料進行親緣關系分析[8]，并將聚類結果指導育種實踐，選育出抗青枯病番茄新品種‘益豐2號[9]。本研究選用櫻桃番茄高代自交系育種材料作為供試材料，分析它們之間的遺傳多樣性，意在從分子水平分析這些育種材料間的遺傳背景，一方面為田間育種實踐提供理論依據和參考，減少雜交組合選配的盲目性，另一方面，將實驗室分子水平親緣關系分析與田間實踐相結合，探尋自花授粉作物遺傳背景趨于狹窄的出路。本研究選用的30份櫻桃番茄高代自交系材料在其田間農藝性狀上各具特色，無從取舍，親本的選擇和選配沒有依據可尋。但通過基于分子水平的聚類分析，很明確地將材料聚成了三大類，在育種實踐中，可以考慮有目的地將不同類群間的種質材料配制雜交組合，產生較強的雜種優勢。

本研究選用的18對InDel標記中，表現多態性的有8對引物，占InDel標記總數的44.4%，而15對SSR標記中，表現多態性的有11對引物，占SSR標記總數的73.3%，表明InDel標記的多態性水平比SSR標記低很多，這與在水稻[10]、大果型番茄[3]上的研究結論相同。在番茄基因組中，雖然InDel標記數量遠遠多過SSR標記，但是它較低的多態性水平在一定程度上限制了InDel標記的應用范圍。

本研究中，30份櫻桃番茄種質材料兩兩間的遺傳距離（GD）在0.052～0.993之間，平均遺傳距離僅為0.391，遺傳距離小于0.5的種質材料占到了77.24%，表明現有櫻桃番茄種質材料的遺傳背景較狹窄，這可能是由于馴化、育種選擇[11]以及櫻桃番茄自身的自花授粉特性造成的，這與申璐[3]等人的研究結論相同。因此，在櫻桃番茄育種中，應注重選用外來資源，包括國外引進資源和野生資源來拓寬種質資源的遺傳基礎。

參考文獻

[1] 姚國新， 黃文超. 利用水稻秈粳分化InDel標記鑒定育種材料的秈粳屬性[J]. 雜交水稻， 2013， 28（3）： 53-57.

[2] 葛 敏， 蔣 璐， 張曉林， 等. 利用Insertion/Deletion（InDel）分子標記檢測玉米互交種混雜的原理及應用[J]. 分子植物育種， 2013， 11（1）： 37-47.

[3] 申 璐， 沈炎林， 柴 敏， 等. 采用InDel和SSR標記分析番茄品種基因組DNA多態性[J]. 中國農業大學學報， 2011， 16（2）： 34-42.

[4] 李斯更， 沈 鏑， 劉 博， 等. 基于黃瓜基因組重測序的InDel標記開發及其應用[J]. 植物遺傳資源學報， 2013， 14（2）： 278-283.

[5] Clark. 植物分子生物學實驗手冊[M]. 顧紅雅， 禮嘉譯. 北京： 高等教育出版社， 1998： 6-9.

[6] 張愛兵， 王正軍， 譚聲江， 等. 分子生態學重要概念--遺傳距離及其測度的理論研究概況[J]. 生態學報， 2002， 22（6）： 943-948.

[7] 姚祝平， 葉青靜， 楊悅儉， 等. 番茄種質資源遺傳多樣性的AFLP分析[J]. 浙江農業學報， 2010， 22（2）： 156-160.

[8] 丘漫宇， 張素平， 郭 爽， 等. 番茄種質資源親緣關系的SSR分析[J]. 中國蔬菜， 2012， （24）： 39-42.

[9] 丘漫宇， 張素平， 劉玉平， 等. 抗青枯病番茄新品種“益豐2號”[J]. 園藝學報， 2013， 40（11）： 2 321-2 322.

[10] 馮芳君， 羅利軍， 李 熒， 等. 水稻InDel和SSR標記多態性的比較分析[J]. 分子植物育種， 2005， 3（5）： 725-730.

[11] Bai Y L， Lindhout P. Domestication and breeding of tomatoes： what have we gained and what can we gain in the future[J]. Annals of Botany， 2007， 100： 1 085-1 094.

責任編輯：葉慶亮