短短芽胞桿菌FJAT—0809—GLX幾丁質(zhì)酶基因chiD的克隆與原核表達(dá)

黃丹丹等

摘 要 以短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX基因組DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到幾丁質(zhì)酶基因chiD序列，再將chiD序列連接到pMD18-T克隆載體上，形成重組載體pMD18-T-chiD，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ɑ并測(cè)序，經(jīng)過(guò)核苷酸和氨基酸序列分析獲得幾丁質(zhì)酶基因chiD的序列片段為1 524 bp，編碼507個(gè)氨基酸，理論蛋白質(zhì)分子量約54.55 ku，其等電點(diǎn)約為5.77，表明該幾丁質(zhì)酶為酸性幾丁質(zhì)酶。將重組質(zhì)粒pMD18-T-chiD雙酶切后與表達(dá)載體pET-28a連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28a-chiD，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果表明：重組蛋白質(zhì)的分子量約55 ku，與預(yù)測(cè)的蛋白分子量結(jié)果一致。為了提高重組蛋白的表達(dá)量，對(duì)培養(yǎng)時(shí)間、IPTG濃度和溫度3個(gè)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析，最后得出重組載體pET28a-chiD的最佳誘導(dǎo)表達(dá)參數(shù)分別為8 h、0.5 mmol/L和28 ℃。這為短短芽胞桿菌來(lái)源的幾丁質(zhì)酶的進(jìn)一步研究奠定了良好基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 短短芽胞桿菌；幾丁質(zhì)酶基因；克隆；表達(dá)；IPTG誘導(dǎo)

中圖分類號(hào) R378 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The chromosome DNA from Brevibacillus brevis FJAT-0809-GLX was treated as a template to obtain chiD chitinase gene by PCR amplification. The recombinant plasmid pMD18-T-chiD was constructed by lingking gene chiD sequence and plasmid pMD18-T. Nucleotides and amino acids sequence of chitinase gene was analyzed and the results showed that gene chiD was 1 524 bp encoding a 54.55 ku protein of 507 amino acids with pI 5.77. The chitinase gene from the recombinant plasmid was linked with the expression vector pET-28a digested with the same two restriction enzymes， and the recombination expression vector pET28a-chiD was conctructed. And the expression vector was transformed into E.coli BL21（DE3） successfully. In order to improve protein expression index， the recombinant expression vector was induced to express and the expression product was detected by SDS-PAGE electrophoresis. The results indicated that the expressed protein molecular weight was about 55 ku， which was consistent with the prediction result. The vector pET28a-chiD was induced to express with different cultural time， isopropyl-p-D-thiogalactopyranoside（IPTG） concentrations and temperature， and the results showed that the best inducing parameters were 8 hours， 0.5 mmol/L and 28 ℃. It would lay a good foundation for the further research of chiD chitinase from B. brevis FJAT-0809-GLX.

Key words Brevibacillus brevis；Chitinase gene；Clone；Express；IPTG induction

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.017

幾丁質(zhì)是由N-乙酰-D氨基葡萄糖以β-1，4糖苷鍵連接而成的線性高分子聚合物[1]，廣泛存在于甲殼類生物、昆蟲的外殼及真菌的細(xì)胞壁中[2]。幾丁質(zhì)酶是一種能夠降解幾丁質(zhì)的內(nèi)切酶，具有一系列復(fù)雜的結(jié)構(gòu)[3]，主要由糖苷水解酶18家族和19家族的成員組成，其中大多數(shù)植物和放線菌產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶屬于19家族，而真菌產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶屬于18家族[4]。其作用機(jī)制為：首先由內(nèi)切幾丁質(zhì)酶將幾丁質(zhì)水解成為由N，N-二乙酰殼二糖苷組成的小分子低聚糖，再由外切β-N-氨基葡萄糖苷酶將這些低聚糖降解為β-1，4-N-乙酰-D-葡萄糖胺[5]。幾丁質(zhì)酶能夠分解昆蟲圍食膜和細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)，破壞昆蟲和病原真菌的防御系統(tǒng)，提高植物的自我防御能力，抑制病原菌的生長(zhǎng)，促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境保護(hù)。

國(guó)內(nèi)外已有許多文獻(xiàn)報(bào)道，將微生物幾丁質(zhì)酶基因成功的在工程菌中克隆和重組表達(dá)。Driss等[6]將幾丁質(zhì)酶成功應(yīng)用于Bacillus thuringiensis細(xì)胞外毒素的重組表達(dá)以增強(qiáng)其抗蟲活性。Hu等[7]將蘇云金芽胞桿菌中的幾丁質(zhì)酶基因和毒蛋白基因整合在一起進(jìn)行組成型表達(dá)，以增加毒蛋白對(duì)農(nóng)業(yè)害蟲的毒害作用。王焰玲等[8]研究環(huán)狀芽胞桿菌C-2中的幾丁質(zhì)酶基因序列在枯草芽胞桿菌中表達(dá)，分析其序列同源性，并作了重組枯草芽胞桿菌對(duì)稻瘟病菌的抑菌試驗(yàn)，其抑菌效果相對(duì)于無(wú)幾丁質(zhì)酶活性的枯草芽胞桿菌提高了46.38%。黃玉杰等[9]也將枯草芽胞桿菌中的幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入伯克氏菌中，構(gòu)建含有重組表達(dá)載體pRChi113的工程菌，檢測(cè)到其對(duì)大麗花輪枝孢、立枯絲核菌、麥根腐長(zhǎng)蠕孢、和谷絲核菌的抑制效果明顯提高。本研究結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，預(yù)將本實(shí)驗(yàn)室保存的一株具有抑菌活性的革蘭氏陽(yáng)性菌[10]短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX中的幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行克隆，并在大腸桿菌中表達(dá)，結(jié)合基因和氨基酸序列預(yù)測(cè)分析，以獲得一個(gè)新的幾丁質(zhì)酶基因序列和其一級(jí)結(jié)構(gòu)信息，為短短芽胞桿菌來(lái)源的幾丁質(zhì)酶的進(jìn)一步研究奠定了良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX、大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室菌種庫(kù)保存，大腸桿菌BL21（DE3）為福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所陳慶河研究員饋贈(zèng)；載體pMD18-T購(gòu)于Takara生物科技有限公司，pET-28a由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤與肥料研究所賈憲波饋贈(zèng)。

1.1.2 酶與試劑 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ購(gòu)自Takara生物有限公司，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自BioTeke公司，dNTPs購(gòu)自北京天根生物有限公司，3 000 bp marker購(gòu)自ferments生物有限公司，Mini Plasmid extraction kit購(gòu)自O(shè)MEGA生物有限公司；X-Gal 和IPTG使用終濃度分別為2%和20%，氨芐青霉素和卡那霉素終濃度均為50 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 引物與PCR擴(kuò)增 以短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX全基因組測(cè)序得到的幾丁質(zhì)酶開(kāi)放閱讀框?yàn)槟０澹O(shè)計(jì)特異性引物，引物兩端分別添加BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，特異性擴(kuò)增幾丁質(zhì)酶基因chiD，引物序列為：chiD01 F′：5′-CGCGGATC

CATGTATTTTTTGATGAGAAAAGC-3′和chiD02R′：5′-CCGCTCGAGTGACTTAATGAATCAAGCGAACT-3′。以短短芽胞桿菌全基因組DNA（按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行提取操作）為模板進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增條件為： 94 ℃，預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min， 72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，完成PCR的擴(kuò)增程序。

1.2.2 幾丁質(zhì)酶基因的克隆 利用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增得到的幾丁質(zhì)酶基因序列產(chǎn)物，將其亞克隆到克隆載體pMD18-T上，16 ℃連接過(guò)夜后熱擊轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α中，用含有40 μL 2% X-Gal、7 μL 20% IPTG和50 μg/mL氨芐青霉素的LB平板進(jìn)行陽(yáng)性克隆子的篩選，挑取白色克隆子作特異性PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，并提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒送至上海博尚生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.3 重組表達(dá)載體pET28a-chiD的構(gòu)建 以重組克隆載體pMD18-T-chiD為模板，chiD01和chiD02為引物，PCR擴(kuò)增幾丁質(zhì)酶基因，擴(kuò)增產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后用DNA凝膠回收試劑盒回收，與同樣經(jīng)過(guò)相同雙酶切處理的表達(dá)載體pET-28a連接，連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并利用含有終濃度50 μg/mL卡那霉素的LB固體平板篩選轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子經(jīng)特異性PCR和酶切電泳鑒定，最后獲得重組質(zhì)粒pET28a-chiD，構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖1。

從重組大腸桿菌DH5α中提取重組質(zhì)粒pET28a-chiD，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子經(jīng)特異性PCR和酶切電泳鑒定，最后獲得陽(yáng)性表達(dá)轉(zhuǎn)化子。

1.2.4 幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化 將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接入含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD值為0.8，加入不同濃度的IPTG，在不同誘導(dǎo)時(shí)間和溫度下誘導(dǎo)重組表達(dá)轉(zhuǎn)化子，并利用SDS-PAGE凝膠電泳分析確定最佳的誘導(dǎo)表達(dá)條件。其誘導(dǎo)條件見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 短短芽胞桿菌幾丁質(zhì)酶基因chiD核苷酸序列分析

將幾丁質(zhì)酶基因chiD序列提交到NCBI，獲得登錄號(hào)為KF894918。由表2可知，DNAman軟件分析得到幾丁質(zhì)酶基因chiD的ORF序列片段長(zhǎng)度為1 524 bp，G+C含量約占總量的49.7%，其雙鏈dsDNA分子量為939.51。在NCBI上進(jìn)行序列比較分析，得出本實(shí)驗(yàn)中短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX幾丁質(zhì)酶核苷酸序列與短短芽胞桿菌NBRC 10059幾丁質(zhì)酶基因chiD的核苷酸同源相似度分別為97%，且與蠟樣芽胞桿菌NC7401、橙色標(biāo)樁菌DW4/3-1、粘細(xì)菌DSM 2259、蘇云金芽胞桿菌Al Hakam和炭疽芽胞桿菌A16的核苷酸均具有較高的同源性，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2 短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX幾丁質(zhì)酶的氨基酸序列分析

利用DNAman和ExPASy蛋白分析軟件中的ProtParam、ScanProsite、SWISS-MODEL、InterProScan、NetNglyc 1.0 server和SOPMA等工具對(duì)所獲基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行在線分析，結(jié)果顯示，幾丁質(zhì)酶基因編碼507個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量約為54.55 ku，理論等電點(diǎn)約為5.77，屬于Ⅱ類幾丁質(zhì)酶和糖苷水解酶18家族。從幾丁質(zhì)酶基因編碼的氨基酸序列比較來(lái)看，短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX與短短芽胞桿菌NBRC 10059、短芽胞桿菌BC25的同源性分別達(dá)到97%和93%，而與其他Ⅱ類幾丁質(zhì)酶序列的同源性在50%～65%。

幾丁質(zhì)酶基因編碼的氨基酸序列見(jiàn)圖2，在chiD的N端，首先為一段含有29個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，該信號(hào)肽可被革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌及其他原核生物識(shí)別，革蘭氏陰性菌的可識(shí)別斷裂位點(diǎn)為Met-30和Phe-32，革蘭氏陽(yáng)性菌和其他原核生物的可識(shí)別位點(diǎn)為Met-30。其后第30～76氨基酸的間隔區(qū)域?yàn)槊傅孜锝Y(jié)合區(qū)，也是糖苷水解酶5～12家族的保守區(qū)，其中芳香族氨基酸Tyr和Trp高度保守。第88～163個(gè)氨基酸間隔區(qū)域?yàn)橐粋€(gè)纖連蛋白Ⅲ折疊區(qū)（Fibronectin， typeⅢ），之后第180～496氨基酸的間隔區(qū)域?yàn)樵搸锥≠|(zhì)酶的酶催化區(qū)域，其中第183～487氨基酸為糖苷水解酶18家族的催化保守區(qū)，第286～294氨基酸為預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)，Glu-294為一個(gè)質(zhì)子供體。N-糖基化位點(diǎn)分析結(jié)果顯示，氨基酸序列中存在8個(gè)天冬氨酸或天冬酰胺的N-糖基化位點(diǎn)，分別位于第91、143、158、193、231、259、309、491位氨基酸，在這些位點(diǎn)后皆存在跨膜螺旋Asn-Xaa-Ser/Thr序列。此外，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明，該蛋白中存在ɑ-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲部分。

2.3 重組表達(dá)載體pET28a-chiD的構(gòu)建

將經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后的幾丁質(zhì)酶基因片段和同樣經(jīng)雙酶切處理的表達(dá)載體pET-28a用T4連接酶進(jìn)行連接，熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并對(duì)獲得的重組表達(dá)載體pET28a-chiD作PCR和雙酶切驗(yàn)證。由圖3可知，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，發(fā)現(xiàn)在約1 500 bp處顯示有清晰條帶，初步確定為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。進(jìn)一步對(duì)陽(yáng)性克隆中的重組質(zhì)粒進(jìn)行提純，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，在約1 500 bp處出現(xiàn)清晰條帶（圖4），最終確定為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，將獲得的重組質(zhì)粒送至博尚生物技術(shù)（上海）有限公司測(cè)序，結(jié)果顯示序列匹配率為100%，說(shuō)明在重組表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程中，幾丁質(zhì)酶基因已正確連接到表達(dá)載體pET-28a上，并未發(fā)生突變。

2.4 重組幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)表達(dá)驗(yàn)證及其誘導(dǎo)條件優(yōu)化

將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）中，構(gòu)建含幾丁質(zhì)酶基因的工程菌。通過(guò)不同的IPTG濃度、時(shí)間和溫度誘導(dǎo)幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)，并采用SDS-PAGE電泳檢測(cè)酶的表達(dá)情況。由圖5可知，當(dāng)IPTG濃度為0.5 mmol/L，28 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)8 h時(shí)（泳道1），在約55 ku處出現(xiàn)清晰的目標(biāo)蛋白質(zhì)條帶（圖5中所示），而陰性對(duì)照組（只含表達(dá)載體pET-28a的大腸桿菌BL21）在相應(yīng)位置未出現(xiàn)目標(biāo)條帶，由此可確定重組表達(dá)載體pET28a-chiD表達(dá)成功。與此相反，其他誘導(dǎo)條件下的泳道中也出現(xiàn)目標(biāo)條帶，但其條帶均較弱，蛋白濃度很低，由此表明最佳的誘導(dǎo)表達(dá)參數(shù)為8 h、0.5 mmol/L和28 ℃。另外，電泳檢測(cè)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)在分子量18、38 ku附近出現(xiàn)微弱的條帶（見(jiàn)圖5中泳道3、7、8、10、11所示），推測(cè)可能是幾丁質(zhì)酶的降解產(chǎn)物[11]。

3 討論與結(jié)論

原核生物的基因片段一般為啟動(dòng)子序列、編碼區(qū)和終止子序列，其編碼區(qū)通常由分泌信號(hào)肽、酶催化區(qū)、粘連蛋白TypeⅢ同源區(qū)和底物結(jié)合區(qū)等4個(gè)基本功能區(qū)構(gòu)成。許多細(xì)菌幾丁質(zhì)酶的氨基酸序列一般表現(xiàn)為N端催化區(qū)域，C端底物結(jié)合區(qū)域，甚至一些細(xì)菌的幾丁質(zhì)酶含有多個(gè)催化區(qū)域，如Howard等[12]研究發(fā)現(xiàn)microbulbifer degradans的幾丁質(zhì)酶B含有2個(gè)催化域，其中N端催化域?qū)锥《茄苌锏慕到馑俾蕿镃端催化域的13.6倍，而C端催化域?qū)锥∪堑慕到馑俾蕿镹端催化域的2.7倍，N端催化域和C端催化域分別表現(xiàn)為外切幾丁質(zhì)酶和內(nèi)切幾丁質(zhì)酶的活性。短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX的幾丁質(zhì)酶催化區(qū)在C端，底物結(jié)合區(qū)在N端，推斷該幾丁質(zhì)酶表現(xiàn)內(nèi)切幾丁質(zhì)酶活性，對(duì)幾丁高聚糖產(chǎn)物的降解效果可能更好。同時(shí)，活性位點(diǎn)對(duì)蛋白酶的功能有著重要影響，糖苷水解酶18家族活性位點(diǎn)的共有基序?yàn)椤癉XDXE”[13-15]，短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX的幾丁質(zhì)酶中含有DLDLE基序，可見(jiàn)第290～294氨基酸為其活性位點(diǎn)的保守殘基，該幾丁質(zhì)酶具有較好的催化活性。另外，信號(hào)肽序列在不同的細(xì)菌中表達(dá)時(shí)其剪切位點(diǎn)會(huì)出現(xiàn)差異[16-17]，夏啟玉等[18]將一株香蕉內(nèi)生細(xì)菌的幾丁質(zhì)酶基因克隆入大腸桿菌，構(gòu)建含信號(hào)肽和不含信號(hào)肽的幾丁質(zhì)酶表達(dá)菌株，進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)兩者在胞外均具有幾丁質(zhì)降解活性，得出此幾丁質(zhì)酶的信號(hào)肽能被BL21識(shí)別，將幾丁質(zhì)酶分泌到培養(yǎng)基中。本研究中預(yù)測(cè)幾丁質(zhì)酶基因chiD編碼的蛋白信號(hào)肽在短短芽胞桿菌中的識(shí)別位點(diǎn)為Met-30， 在大腸桿菌中識(shí)別位點(diǎn)變?yōu)镸et-30和Phe-32，且在重組大腸桿菌胞外也檢測(cè)到幾丁質(zhì)酶活性為5.09 U/mL（文中未描述），推斷大腸桿菌BL21可識(shí)別該幾丁質(zhì)酶的信號(hào)肽，并將其分泌到胞外。

幾丁質(zhì)酶基因chiD在載體pET-28a的T7啟動(dòng)子調(diào)控下能夠誘導(dǎo)表達(dá)，且誘導(dǎo)條件不同，其重組工程菌的表達(dá)量不同。Ye等[19]將沙雷氏菌中的幾丁質(zhì)酶基因與表達(dá)載體pET-28a重組，并在大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，得到其最佳誘導(dǎo)參數(shù)分別為4 h、0.5 mmol/L和25 ℃，幾丁質(zhì)酶的表達(dá)量在此條件下更大。而本實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化含有重組表達(dá)載體pET28a-chiD的大腸桿菌工程菌的表達(dá)條件，獲得的最佳誘導(dǎo)參數(shù)分別為8 h、0.5 mmol/L和28 ℃，此條件下SDS-PAGE圖譜中蛋白條帶更明顯，由此說(shuō)明工程菌的生長(zhǎng)時(shí)間和溫度會(huì)影響重組酶的誘導(dǎo)表達(dá)，IPTG的添加濃度也會(huì)對(duì)表達(dá)量產(chǎn)生影響。另外，本實(shí)驗(yàn)重組表達(dá)的幾丁質(zhì)酶預(yù)測(cè)等電點(diǎn)約為5.77，呈現(xiàn)酸性，與短芽胞桿菌屬其他亞種的堿性幾丁質(zhì)酶[20-21]存在差異，這說(shuō)明短芽胞桿菌屬細(xì)菌的幾丁質(zhì)酶有著多樣性。

短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX具有較好的抑菌效果和果品保鮮作用[22-23]，其抑菌功能物質(zhì)也有初步研究[23]，但對(duì)其幾丁質(zhì)酶的研究甚少。同時(shí)，由于短芽胞桿菌屬細(xì)菌中幾丁質(zhì)酶的研究大多停留在分離純化層面，關(guān)于其基因的分子克隆與重組表達(dá)的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，因此本研究構(gòu)建了短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX基因克隆和原核表達(dá)體系，為該幾丁質(zhì)酶基因的活性功能位點(diǎn)的研究奠定基礎(chǔ)，為其它功能基因的研究提供平臺(tái)，后續(xù)工作將對(duì)重組表達(dá)幾丁質(zhì)酶的相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)和功能調(diào)控機(jī)制做進(jìn)一步的研究。

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