枇杷花藥胚狀體成苗條件的優化

潘翠萍等

摘 要 以‘大五星枇杷花藥培養獲得的子葉胚為材料，研究基本培養基、蔗糖濃度、4 ℃低溫處理、飽和CaCl2脫水處理、“4℃低溫+飽和CaCl2脫水”處理對胚狀體成苗的影響，并優化枇杷花藥培養及植株再生技術體系。結果表明：枇杷花藥胚狀體經“4 ℃低溫+飽和CaCl2脫水”預處理7 d效果最佳；將預處理后的胚狀體種于萌發培養基1/2MS+3%蔗糖，胚狀體成苗率最高，為78.2%；將再生植株移栽入配比為腐熟有機肥 ∶ 園土 ∶ 鋸末=1 ∶ 2 ∶ 1的基質中時，組培苗移栽成活率達85.25%。

關鍵詞 枇杷；花藥培養；子葉胚；成苗

中圖分類號 S667.3 文獻標識碼 A

Abstract The anther-derived cotyledon embryoid of loquat（Eriobotrya japonica Lindl. cv. ‘Dawuxing）was used as material to optimize the plant regeneration system. A series of experiments were carried out to investigate the effects of basic medium， sucrose concentrations， 4 ℃ low temperature pretreatment， saturated CaCl2 dehydration pretreatment and“4 ℃ low temperature + saturated CaCl2 dehydration”pretreatment on plantlet formation of microspore embryoid in Loquat. The results showed that after pretreatment in“4 ℃ low temperature+ saturated CaCl2 dehydration ” for 7 days， the plantlet formation rate was the highest. 78.2% of complete plantlets were succesfully obtained on 1/2 MS medium supplemented with 3.0% sucrose after the embryos were pretreated for 7 days in “4 ℃ cryogenic treatment and saturated CaCl2 dehydration”. The complete plantlets survived at a rate of 85.25% in the transplantation matrix of decomposed organic fertilizers， garden soil and sawdust（1 ∶ 2 ∶ 1）.

Key words Loquat；Anther culture；Cotyledon embryoid；Plantlet formation

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.019

枇杷童期長，基因雜合度高，常規育種周期長，可達10～20 a[1]。近年來日趨完善的遺傳轉化技術為枇杷的育種開辟了一條新途徑[2]。枇杷遺傳轉化工作一直都受到關注，但是進展相當緩慢，外植體再生難度大且遺傳轉化方法及條件均未成熟[3]，國內外尚未見枇杷轉基因植株成功的報道。

植物遺傳轉化的眾多研究已經證明，胚狀體是理想的遺傳轉化受體系統[4]。迄今為止，轉基因果樹多是通過胚狀體發生途徑獲得的[5]。有關枇杷花藥胚狀體方面的報道較少，李俊強[6]初步建立了枇杷花藥培養及植株再生技術體系，隨后，秦紅玫[7]和楊志武[8]對枇杷花藥胚胎的發生及發育過程進行了組織細胞學觀察，并對枇杷花藥胚狀體的誘導及成苗條件進行了篩選，但胚狀體成苗率低的問題一直未能得到很好解決，限制了該項技術的廣泛應用。

因此，本實驗以‘大五星枇杷花藥培養獲得的子葉胚為材料，對影響枇杷花藥胚成苗的因素進行了優化，完善了枇杷花藥胚狀體再生技術體系，為利用基因工程手段進行枇杷種質改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

‘大五星枇杷花藥胚狀體保存于四川農業大學生物技術研究中心實驗室，保存培養基為MS+ ZT 0.05 mg/L+NAA 0.02 mg/L+IBA 0.02 mg/L+瓊脂7.5 g/L+蔗糖30 g/L，選取子葉胚為試材（圖1-A）。

1.2 方法

1.2.1 胚狀體的萌發成苗 ①不同預處理方式對胚狀體萌發成苗的影響。選取長勢基本一致的‘大五星枇杷花藥子葉胚，進行萌發前預處理：（1）4 ℃低溫處理：設置7、14、21、28、35、42 d共6個時段（人工氣候箱調節），以不作處理為對照；（2）飽和CaCl2脫水處理：將子葉胚置于飽和CaCl2 環境條件下，設置5個時間段1、3、5、7、9 d，以不作處理為對照； （3）“飽和CaCl2脫水+4 ℃低溫”處理：將胚狀體置于飽和CaCl2環境條件下，同時進行4 ℃低溫處理，處理時間設置為1、3、5、7、9、11 d，6個時段，以不作任何處理為對照。所有處理完成后將花藥胚轉入成熟、萌發培養基1/2 MS+蔗糖30 g/L+瓊脂7.5 g/L中。每個處理接種50個胚狀體，重復3次，培養30 d后統計胚狀體成苗率（萌發成完整植株的胚狀體數/接種的胚狀體數×100%）。

②基本培養基及蔗糖濃度對胚狀體萌發成苗的影響。選取長勢基本一致的‘大五星枇杷花藥子葉胚，用篩選出的預處理條件進行預處理后接種于胚狀體萌發培養基上，胚狀體萌發基本培養設置為（MS、1/2MS）、添加不同濃度的蔗糖15、30、50 g。每個處理接種50個胚狀體，重復3次，培養30 d后，統計胚狀體成苗率（萌發的胚狀體數/接種的胚狀體數×100%）和長勢。

1.2.2 再生植株的煉苗移栽 當再生小植株根長為3～5 cm時即可進行煉苗移栽，方法是在培養室揭去封口膜培養3 d，然后取出試管苗洗去培養基，移栽到含有不同配比的基質中，每種基質移栽30株，重復3次，常規管理，30 d后統計移栽成活率（移栽成活的組培苗數/移栽組培苗數×100%）。

1.2.3 培養條件 培養溫度（25±1）℃，光照時間14 h/d，光照強度為30 μmol/（m2·s）。

1.3 數據分析

所得數據用DPS 7.05軟件進行統計分析，多重比較采用Duncan新復極差法。

2 結果與分析

2.1 胚狀體的萌發成苗

2.1.1 不同預處理對胚狀體萌發的影響 胚狀體不進行預處理，形成完整植株的百分率低（5.3%～6.0%），大部分胚狀體僅形成了根（42.5%～45.1%），而沒有芽的分化。少部分胚狀體僅形成了芽（7.5%～8.6%），而沒有根的分化。可見，胚狀體的發育有3種情況：僅形成根，而不分化出芽（圖1-B）；僅分化出芽，而不形成根（圖1-C）；既分化出根又分化出芽，形成完整植株（圖1-D～E）。

不同預處理方式對枇杷花藥胚狀體成苗率的影響有較大差異。3種預處理方式（4℃低溫處理、飽和CaCl2脫水處理、“4℃低溫+飽和CaCl2脫水”處理）均能顯著提高胚狀體的成苗率，隨著處理時間的延長，3種處理方式胚狀體的成苗率均呈現出先增加后降低的趨勢，當4℃低溫處理時間為28 d時，胚狀體成苗率為62.4%，顯著高于其它低溫各處理（表1）；飽和CaCl2脫水處理7 d時，胚狀體成苗率為50.4%，為脫水處理中最高（表2）；對枇杷胚狀體進行“4 ℃低溫+飽和CaCl2脫水”處理7 d時，胚狀體成苗率高達76.6%，為所有處理中最高（表3）。綜上所述，“4℃低溫+飽和CaCl2脫水”處理7 d，為枇杷胚狀體成苗最佳的預處理方式。

2.1.2 基本培養基和蔗糖濃度對胚狀體的萌發成苗的影響 基本培養基和蔗糖濃度對枇杷胚狀體成苗的影響見表4。當基本培養基一定時，胚狀體成苗率隨著蔗糖濃度的升高（1.5%～5.0%），呈現出先上升后降低的趨勢。當蔗糖濃度為3.0%時，成苗率高，達72.5%（MS）和78.2%（1/2MS））； 當蔗糖濃度為5.0%時， 成苗率較低，為47.5%（MS）和40.1%（1/2MS）；當蔗糖濃度為1.5%時，成苗率居中， 為50.4%（MS）和55.3%（1/2MS）。為進一步分析基本培養基和蔗糖濃度對胚狀體成苗率影響的差異性，對胚狀體成苗率進行了F檢驗，結果表明：蔗糖濃度對胚狀體成苗的影響達到了極顯著水平（F=510.77，p<0.01），而基本培養基對胚狀體成苗的影響則不顯著，F值為1.32。多重比較結果顯示，蔗糖濃度為3%時，胚狀體成苗率最高，極顯著高于其它處理。綜上所述，枇杷花藥胚狀體萌發的適宜培養基為1/2MS+3%蔗糖。

2.2 再生植株的煉苗移栽

經煉苗移栽后的生根小植株，在不同的移栽基質里植株成活率和植株長勢差異較大。從表5可看出，移栽基質配比為腐葉土 ∶ 珍珠巖=3 ∶ 1時，組培苗移栽成活率為45.62%，植株葉片小，莖桿細，葉色泛黃，長勢弱；移栽基質配比為腐熟有機肥 ∶ 園土 ∶ 鋸末=1 ∶ 2 ∶ 1時，組培苗移栽成活率達85.25%，植株葉片大，莖桿粗壯，葉色深綠，長勢健壯（圖1-E）。由此可見，腐熟有機肥 ∶ 園土 ∶ 鋸末=1 ∶ 2 ∶ 1為枇杷生根組培苗移栽的適宜基質。

3 討論與結論

植物花藥培養中胚狀體成苗率低甚至得不到再生植株的現象比較普遍[9]。許多物種存在胚狀體質量差，成熟度不高，抗性低等問題，最終造成了成苗率低[10]。因此，對胚狀體進行萌發前預處理就顯得尤為重要。

據文獻報道，促進胚狀體萌發的方法很多，如植物激素浸泡處理[11]，胚狀體形態篩選[12]，低溫處理[13]，脫水處理[14-15]，在培養基中添加植物生長調節劑或其它物質[16]以及液體培養[17]等。李俊強等[6]報道枇杷花藥胚狀體較難成苗，正常情況下僅有5%的胚狀體能夠形成完整植株，秦紅枚[7]研究認為枇杷花藥胚狀體經一定時間脫水處理后其成苗率比對照提高了14.9%。本實驗系統探討了低溫處理（4 ℃）、飽和CaCl2脫水處理以及‘4 ℃低溫+飽和CaCl2脫水處理對胚狀體成苗的影響，結果表明：未經處理的枇杷胚狀體形成完整植株的比率低，為5.3%～6%。對胚狀體進行一定時間的低溫處理（4 ℃）、飽和CaCl2脫水處理以及‘4 ℃低溫+飽和CaCl2脫水處理均能有效的提高胚狀體的成苗率，其中以‘4 ℃低溫+飽和CaCl2脫水處理7 d效果最佳，其成苗率為76.6%。

研究表明，胚狀體成熟時，除了形態和結構發育外，還需要積累一定的能源物質（淀粉和多糖的積累），從而起到為新發育階段提供能量的作用[18]。通常認為脫水處理能使胚狀體誘導產生代謝停滯的狀態，從而使許多物種胚狀體能夠長時間貯藏，同時，脫水過程中水分的丟失被認為是建立對干旱耐受性的信號[15]。

Pond等[19]研究表明，低溫處理可以部分地替代脫水處理，在脫水時同時進行低溫處理增強了體胚的抗逆性，從而促進了胚的萌發。

本研究以‘大五星枇杷花藥子葉胚為材料，完善了‘大五星枇杷花藥培養及植株再生技術體系，為利用轉基因技術對體枇杷進行遺傳改良奠定了一定的基礎。

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