GC-MS對非釀酒酵母菌發酵赤霞珠葡萄酒香氣成分的檢測

徐亞男，劉秋萍，李 琦，王 月，單春會，肖 婧，史學偉*

（石河子大學 食品學院，新疆 石河子 832000）

葡萄酒發酵前期存在大量非釀酒酵母[1]，與釀酒酵母相比，非釀酒酵母能產生和分泌多種胞外酶[2]：膠質酶可增加葡萄汁的提取，促進酒的澄清；β-葡萄糖苷酶是水解的非揮發性的糖苷香氣物質前體；蛋白酶能增加澄清；酯酶是重要的發酵香氣成分；脂肪酶能分解葡萄酒中或酵母自溶的脂肪。這些酶與葡萄汁相互作用，產生不同的品種和發酵香氣[3]。國內研究非釀酒酵母對葡萄酒香氣成分影響的報道較少[4]。此外，在我國還未形成利用芳香成分作為評價葡萄酒質量的系統[5]。隨著科學技術的發展，香氣成分鑒定技術趨于成熟，芳香成分將成為葡萄酒評價的一個重要組成部分。因此，準確的分析檢測葡萄酒中各種香氣物質組成對葡萄酒感官特點的改善及釀造工藝的控制具有積極的意義。

本實驗室前期在新疆葡萄自然發酵過程中采集大量酵母菌，通過26S rRNA測序得到19株非釀酒酵母菌，選擇其中發酵能力較強的7株與工業菌株混合發酵新疆赤霞珠干紅葡萄酒，對其香氣成分進行氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析，以期確定該品系的香氣特點、釀酒性能，選育出優質非釀酒酵母菌，為生產釀造出具有地域特色的葡萄酒提供理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄樣品：新疆赤霞珠葡萄。

非釀酒酵母菌株Y2（Galactomycessp.）、Y3（Rhodotorulasp.）、Y5（Candidasp.）、Y10（Hanseniasporasp.）、Y13（Meyerozymasp.）、Y16（Pichiasp.）、Y19（待進一步鑒定）均由本實驗室保藏，經26S rRNA測序，系統進化樹見圖1。

工業菌株：D-254、L-2323 購自澳大利亞瑪麗酵母有限公司。

試驗所用試劑及藥品均為試劑純、分析純，購自新疆沃德生物公司。

1.2 儀器與設備

GC-MS3100型氣相色譜質譜計算機聯用儀：北京東西分析儀器有限公司；R-200增強型旋轉蒸發儀：瑞士BUCHI公司；BILON-650Y型超聲波萃取儀：上海比朗精密儀器有限公司；85-2型恒溫磁力攪拌器：上海喬楓實業有限公司；pHS-3b型精密pH計：日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 葡萄汁預處理

采自新疆葡萄產區赤霞珠葡萄，經去梗破碎成汁，加熱至70 ℃保持20 min，冷卻至室溫后重復操作連續3 d，以消除自然微生物的影響[6]。

1.3.2 混合發酵葡萄酒

以本實驗室前期研究非釀酒酵母菌與工業菌株混合發酵的最佳工藝發酵葡萄酒。

1#酒樣：前期添加非釀酒酵母Y2，20 ℃發酵54h后接入工業菌株D-254，25 ℃混合發酵，接入比例為1∶3，總接種量為0.08%，發酵120h結束，裝瓶；2#酒樣：前期添加非釀酒酵母Y3，其他條件與1#酒樣相同；3#酒樣：前期添加非釀酒酵母Y5，其他條件與1#酒樣相同；4#酒樣：前期添加非釀酒酵母Y19，其他條件與1#酒樣相同；5#酒樣：前期添加非釀酒酵母Y13，其他條件與1#酒樣相同；6#酒樣：前期添加非釀酒酵母Y16，其他條件與1#酒樣相同；7#酒樣：前期添加非釀酒酵母Y10，其他條件與1#酒樣相同；8#酒樣：工業菌株D-254，活化后25 ℃發酵，接種量為0.08%，發酵120h結束，裝瓶；9#酒樣：新疆某葡萄酒廠剛發酵的成品酒，發酵菌株為L-2323。

1.3.3 酒樣預處理[7]

取50 mL酒樣加入100 mL具塞錐形瓶中，用移液槍吸取20 μL 2-辛醇（l.000 969 g/L）酒精溶液（內標物），稱取2 g MgSO4，吸取20 mL二氯甲烷，用封口膜快速完成密封隔絕空氣；具塞錐形瓶放置在可控溫的磁力攪拌器上的冰浴里，溫度控制在0 ℃完成攪拌萃取（500 r/min）l h后混合液經超聲波萃取15 min（25 ℃），收集有機相，無水硫酸鈉干燥，旋轉蒸發儀濃縮至2 mL，氮吹至l mL，供GC/MS上機分析。

1.3.4 色譜條件[8]

進樣口溫度260 ℃，柱溫箱起始溫度60 ℃，保留時間2.5 min，6 ℃升至240 ℃，保留15 min；載氣為He，恒流1 mL/min；分流比80∶1。質譜條件：電離方式電子電離源（electron ionization，EI），電離電壓70 eV，離子源溫度200 ℃，連接桿溫度260 ℃。

1.3.5 數據分析

數據處理[9]：獨立重復進行3次試驗，結果表示3次測定的平均值。試驗所得數據反復進行方差分析，顯著性差異通過T檢驗計算；

香氣成分定性分析[10]：采用質譜計算機自帶的NIST 2.0和Wiley譜庫檢索定性，各香氣物質組分的質譜經計算機譜庫檢索，結合解析譜圖，確定香氣物質；

香氣成分定量分析[11]：采用內標法，以2-辛醇作為內標物對葡萄酒香氣成分進行定量分析，計算出香氣物質的含量。計算公式[12]：

式中：設f=1，內標濃度為100%

2 結果與分析

2.1 26S rRNA測序結果

試驗所用菌株的26S rRNA系統發育分析見圖1。

圖1 26S rRNA 基因序列的酵母菌株系統發育分析Fig.1 26S rRNA gene sequence phylogenetic analysis of yeast strains

2.2 GC-MS檢測結果

1#～9#葡萄酒樣香氣成分GC-MS總離子圖見圖2～圖10。

圖2 1#葡萄酒樣香氣成分GC-MS總離子圖Fig.2 GC-MS total ion chromatogram of 1#wine aroma components

圖3 2#葡萄酒樣香氣成分GC-MS總離子圖Fig.3 GC-MS total ion chromatogram of 2#wine aroma components

圖4 3#葡萄酒樣香氣成分GC-MS總離子圖Fig.4 GC-MS total ion chromatogram of 3#wine aroma components

圖5 4#葡萄酒樣香氣成分GC-MS總離子圖Fig.5 GC-MS total ion chromatogram of 4#wine aroma components

圖6 5#葡萄酒樣香氣成分GC-MS總離子圖Fig.6 GC-MS total ion chromatogram of 5#wine aroma components

圖7 6#葡萄酒樣香氣成分GC-MS總離子圖Fig.7 GC-MS total ion chromatogram of 6#wine aroma components

圖8 7#葡萄酒樣香氣成分GC-MS總離子圖Fig.8 GC-MS total ion chromatogram of 7#wine aroma components

圖9 8#葡萄酒樣香氣成分GC-MS總離子圖Fig.9 GC-MS total ion chromatogram of 8#wine aroma components

圖10 9#葡萄酒樣香氣成分GC-MS總離子圖Fig.10 GC-MS total ion chromatogram of 9#wine aroma components

2.3 NIST譜庫檢索分析

對檢測到的化合物通過NIST譜庫進行檢索，選取匹配度大于800以上的所有化合物，9種酒樣中共檢測到16種物質，其中酯類物質7種，醇類6種，其他香氣物質3種（見表1）。

由表1可知，檢測到赤霞珠葡萄酒的主要香氣成分為3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、2-甲基-丙醇、1-己醇、辛酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、琥珀酸二乙酯、3-羥基丁酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸己酯。

以Y10（Hanseniasporasp.）孢漢遜酵母屬發酵的7#赤霞珠葡萄酒的主要優勢特征香氣較其他組分略高，尤其是己酸乙酯高于工業菌株D-254發酵8#葡萄酒；乙酸己酯、糠醛高于成品酒9#。說明非釀酒酵母菌與工業菌株混合發酵方法可行，可以在一定程度上提高葡萄酒的香氣成分。

2.4 主要香氣成分分析

（1）醇類：主要來源于發酵、氨基酸的轉化及亞麻酸降解物的氧化[13]，本次試驗檢測到醇類物質6種，試驗中所有酒樣的3-甲基-1-丁醇、苯乙醇相對含量較高，苯乙醇具愉快的玫瑰花香、薔薇香氣、茉莉香、丁香、花粉味；2-甲基-1-丙醇相對含量也較高，具青草、植物香氣。說明在酒精發酵過程中，酵母發酵使醇類化合物大量生成，最終構成了葡萄酒的香氣成分。

（2）酯類與內酯類：葡萄酒中的酯類主要來源于3種途徑[14]：存在于葡萄漿果果皮中的構成果香的酯類；在發酵過程中由酵母菌和細菌活動形成的酯類；在貯藏過程中由酯化反應形成的酯類。本次試驗共檢測到酯類物質7種，辛酸乙酯含量最高，具青蘋果味、果香、草莓香、茴香味，有益于葡萄酒的香氣質量；己酸乙酯具有果香、青蘋果味、香蕉味、白蘭地味；癸酸乙酯具有白蘭地味、果香、葡萄香。其構成了葡萄酒的主要香氣特征。

（3）在酒精發酵中生成的有機揮發酸，主要是乙酸、戊酸和異戊酸以及每升幾百毫克的己酸、辛酸及葵酸等。其他酮類、酚類和醚類化合物在9種酒樣中均未檢測到。

3 結論

以不同非釀酒酵母菌株與工業菌株混合發酵赤霞珠葡萄酒，GC-MS分析其香氣成分，結果表明，非釀酒酵母菌株與釀酒酵母菌株混合發酵，可以把漿果中的中性化合物轉化為芳香化合物[6]，增加酒的香氣成分，進而增加酒的感官特性。

葡萄酒香氣是葡萄酒品質評價的重要標準之一[13]，近年來，葡萄酒香氣成分的研究呈上升趨勢，到目前為止，已經被鑒定存在于葡萄酒中具有揮發能力的化學物質大約在1 000種以上[13]，可劃分為醇類物質、酯類物質、酸類物質等九大類，這些香氣物質在同一葡萄酒環境中通過相互作用構成了每種葡萄酒獨有的香氣類型。而在本次試驗中，香氣成分檢測較少，試分析原因如下：

（1）葡萄酒是十分復雜的酒精飲料[14]，香氣成分種類繁多，一些成分含量極低，很難被檢測到，另一些成分極其不穩定，在分離提取時容易發生結構變化。因此，分析葡萄酒香氣成分是一項復雜的研究工作。由于香氣成分極低的物質必須在高度富集的條件下才能被檢測到；另外在葡萄酒的香氣分離提取過程中會人為添加一些非原葡萄酒具有的香氣或者一些其他有機雜質，這部分香氣或有機物質可能會在GC-MS分析圖譜圖中覆蓋或者影響葡萄酒中原有的一些香氣成分；

（2）本試驗樣品為發酵剛剛結束酒樣，此時酒體粗糙、酸澀，飲用質量較差，通常稱之為生葡萄酒[15]，此時香氣成分較少，不易檢測。必須經過一系列的物理、化學變化后，才能達到最佳飲用質量；本次試驗在對照試驗設計中，應以陳釀成品酒作對照，李記明等[16]研究發現，葡萄揮發性香氣物質不僅有明顯的品種差異，而且有典型的年份特征；

（3）香氣成分預處理，本試驗所用方法為液液萃取，因為有機溶劑具有同時萃取葡萄酒中的高、中、低濃度香氣物質的能力[17]。但是萃取液經過蒸餾和濃縮，也許會導致一部分香氣物質的降解或形成一些新的物質，從而影響葡萄酒香氣分析的準確性。

后期研究的重點是分析不同陳釀時間、不同樣品處理方式對葡萄酒香氣成分的影響，研究其具體的特征香氣以及形成機理。

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