野生蘋果酒產香酵母的分離及篩選

趙海霞，華惠敏，吳桂君

（銀川能源學院 生物與農業工程學院，寧夏 永寧 750105）

近年來，蘋果酒因含有蘋果與生物發酵所產生的雙重營養成分，具有抗衰老、軟化血管降血脂及美容養顏等保健作用[1]而受到越來越多的消費者青睞。目前，我國生產蘋果酒使用的酵母多為葡萄酒等其他果酒專用釀酒酵母，而缺少蘋果酒專用發酵菌種，而優良蘋果酒的發酵不是僅由單一酵母完成的，單一酵母往往會造成產品風味上的缺陷，口味較平淡[2]。所以人們試圖利用具有增加蘋果酒香氣風味的非酵母屬酵母和具有高發酵效率的酵母屬酵母進行混合發酵釀造蘋果酒，既增加蘋果酒中的酯香物質含量，同時又保證了用于蘋果酒發酵的酵母具有較高的發酵效率。果酒發酵中賦予酒香的酵母被稱為產香酵母，如孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、克勒克酵母屬（Klaeckera）、假絲酵母屬（Candida）和畢赤酵母屬（Pichia）等[3]。它們在發酵過程中產生一些高級醇、低級脂肪酸和酯類等芳香物質，使得果酒氣味芬芳，果香濃郁[4]。

因此，本文針對蘋果酒釀造中所需菌種缺乏的現狀，通過測定從自然界分離的4株產香酵母對160 mg/L的SO2和10%vol酒精度的耐受性后，與釀酒酵母進行混合發酵試驗，選出J-4號菌更適合作為蘋果酒釀造的產香酵母。其發酵所得蘋果酒品質優，且酒的香味濃郁，風味飽滿，酒體醇厚，具有蘋果酒的典型風味，適用于果酒生產。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土壤：采自寧夏銀川市永寧縣小任果業蘋果園中；紅富士蘋果：購自永寧縣小任果業。

“安琪”果酒用高活性干酵母：湖北安琪酵母股份有限公司生產；N號釀酒酵母：北方民族大學國家民委重點實驗室提供。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）固體培養基：葡萄糖2%，酵母膏1%，蛋白胨2%，瓊脂2%。

YEPD液體培養基：葡萄糖2%，酵母膏1%，蛋白胨2%。

發酵培養基：寧夏紅富士清洗、破碎、榨汁，用白砂糖調整果汁糖度，使含糖量為216g/L，用酒石酸、碳酸鈣調整果汁的酸度，使酸含量為（以酒石酸計）6 g/L，添加H2SO3（按6%添加量），使SO2含量為80 mg/L，采用巴氏消毒法滅菌，65℃30 min。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-IF超凈工作臺：蘇中凈化設備有限公司；（LED）XSP-10C顯微鏡：上海永亨光學儀器制造有限公司；756MC型紫外可見光分光光度計：上海舒耀儀器設備有限公司；SHP-250型智能生化培養箱：上海鴻都電子科技有限公司；LDZX-50KBS立式蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；HR-200電子分析天平：日本A&D 公司；DELTA320 pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；微量可調式移液槍：Gilson；BCD-219D冰箱：青島海爾股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌的分離

無菌稱取10 g土壤放入盛有90 mL無菌水的三角瓶中，振蕩均勻，制成菌懸液，以10-3、10-4、10-5及10-6為濃度梯度，每皿接種量200 μL的接種量，每濃度3個平行進行YEPD固體涂布分離酵母菌。

1.3.2 產香酵母的篩選

產香酵母的初篩：將分離出來的酵母菌株，接種YEPD液體培養基活化后接種到YEPD固體培養基28 ℃培養48 h后觀察，篩選出能產氣味的菌株。

傳代培養：篩選的野生酵母一般性能不穩定，為了保證后續試驗的順利進行，將已經純化的產香酵母進行傳代培養5～6次，將性能穩定優良的菌種進行YEPD培養基斜面保存。

1.3.3 產香酵母的性能測定[5]

對初次篩選的產香酵母進行耐SO2及耐酒精性進行測定。

（一）耐酒精能力的測定

配置YEPD液體培養基使酒精度分別為8%vol、10%vol、12%vol、14%vol、16%vol；將各梯度培養液分別分裝，每支試管裝液量10 mL，每個菌種做3個平行，每管中接入菌懸液0.5 mL，菌懸液濃度為107個/mL。以安琪牌果酒釀酒酵母為對照，32 ℃，180 r/min進行搖床培養24 h后600 nm處測定吸光度值，用比濁法測定菌體生長量以確定酵母菌的耐酒精能力并進行美蘭染色鏡檢。

（二）耐SO2性能的測定

分別配置SO2含量為100 mg/L、120 mg/L、140 mg/L、160 mg/L的YEPD液體培養。分別分裝，每支試管裝液量10 mL，每個菌種做3個平行，以安琪牌果酒釀酒酵母為對照，32 ℃，180 r/min進行搖床培養24 h后600 nm處測吸光度值，用比濁法測定菌體生長量以確定酵母菌耐SO2的性能。

1.3.4 產香酵母的復篩

將初篩出的各產香酵母與N號菌按1∶1混合，同時，以“安琪”果酒專用高活性干酵母為對照K，分別接種于發酵培養基，接種量為250 mg/L，室溫發酵，測定其還原糖、滴定酸的變化，當其還原糖含量＜5 g/L時，用蒸餾比重法測其酒精度，并對其進行感官評定，主要是評定各菌種在有酒精產生的環境中，芳香物質的產生情況，篩選出適合蘋果酒釀造的產香能力強的菌種。

1.3.5 酵母的分子鑒定

取0.2 g左右研磨好的樣品，采用KI法[6]提取基因組DNA，-20 ℃保存備用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

ITS擴增及檢測：參照ITS通用引物序列[7]及GenBank中登錄的Cortinarius屬rDNA ITS序列，設計引物對序列為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），由TaKaRa公司進行合成。

50 μL擴增體系：10×PCR Buffer（含Mg2+）5 μL，dNTP 2.5 μL，引物各1 μL，模板0.5 μL，TaqDNA聚合酶1 μL，ddH2O 39 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共30個循環；72 ℃延伸7 min。反應完成后，加6×上樣緩沖液混勻，于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.6 測定方法

還原糖測定方法[8]：斐林試劑法。

酸的測定方法[8]：酸堿中和滴定法。

酒精度測定方法[8]：蒸餾比重法。

果酒感官評定[9]：依據GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中果酒感官評定表對其進行打分。

2 結果與分析

2.1 產香酵母初篩結果

根據菌落形態、顯微觀察以及平皿的香味評定初次篩選出5株形態、香味各異的酵母菌。

表1 5株酵母菌菌落特征與菌體形態Table 1 Colony morphology and mycelial morphology of 5 strains

從表1看出J-3在固體平板上培養，散發出異臭味被淘汰，其他菌用斜面保存備用。

2.2 產香酵母的性能測定結果

（1）產香酵母對酒精耐受力的測定結果：

在一定濃度范圍內，菌懸液中細胞濃度與液體光密度成正比，與透光度成反比，通過比濁法測培養24 h后菌的濃度來反應各菌在不同濃度酒精培養基中的生長情況。由圖1看出，產香酵母在含10%vol酒精的液體培養基中，4株菌的OD值均＞0.10，4株產香酵母在此酒精濃度中菌體生長良好，為了更好的確定4株菌的形態和出芽情況，進行了美藍染色的酵母菌死活細胞鑒定，鏡檢結果見圖2。由圖2可知，4株菌出芽情況好且活細胞多。產香酵母的耐酒精能力到10%vol，而果酒的酒精度一般＜10%vol，故而4株菌均適用于蘋果酒的釀造。在其他濃度14%vol～16%vol中OD值的波動較大，甚至出現OD值＜0.10的情況，菌體的長勢參差不齊。在蘋果酒發酵過程中，酵母代謝的主要產物是乙醇，酒精度過高會對產香酵母的新陳代謝產生抑制作用[10]，因此具有酒精抗性的產香酵母有利于蘋果酒混合發酵的順利進行。

圖1 產香酵母對酒精耐受力的測定結果Fig.1 Ethanol tolerance of aroma-producing yeast

圖2 4株菌在10 %vol酒精液體培養基中美藍染色結果Fig.2 Dyeing results of 4 strains cultured in 10 %vol alcohol liquid medium with methylene blue

（2）產香酵母對SO2的耐受性的測定結果：

從圖3中看出，4株產香酵母分別在SO2含量為100 mg/L、120 mg/L、140 mg/L、160 mg/L的YEPD液體培養基中測得OD值均0.25，且都耐受160 mg/L SO2，其中J-1和J-2在4個含SO2濃度梯度的培養基中測得的OD值在0.3左右，菌體生長慢，J-4和J-5 在4個含SO2濃度梯度的培養基中測得的OD值在0.65左右，菌體生長快。SO2具有光譜抗菌活性，在果酒釀造中主要起殺菌的作用。在一定濃度下，SO2可以抑制或殺死酵母細胞。在蘋果酒釀造過程中，對SO2有較高耐受力的產香酵母更適合作為釀酒菌種，因此J-4和J-5更適合果酒釀造。

圖3 產香酵母的耐SO2能力Fig.3 SO2resistant capacity of aroma-producing yeast

2.3 產香酵母復篩結果

2.3.1 發酵過程的還原糖變化

用菲林試劑法測定發酵過程中還原糖的變化，從圖4可以看出，各個菌發酵過程中還原糖逐漸減少，發酵過程順利穩定進行。J-5菌因在發酵結束后糖含量為9.1g/L，與其他菌相比較，還原糖含量較高、發酵能力較弱而被淘汰。J-1、J-2、J-4菌發酵結束后還原糖含量＜4 g/L，有較強的發酵能力，但J-1和J-2耐受SO2的能力較差，所以J-4在整個發酵過程中較其他篩選菌發酵能力較強，更適合作為蘋果酒的釀造菌。

圖4 發酵過程的還原糖含量變化Fig.4 Reducing sugar changes during fermentation process

2.3.2 果酒的感官評定

從表2中看出，J-1、J-2和N號釀酒酵母混合發酵，酒精度低，感官評定結果差，香味不佳；J-4、J-5和N號葡萄酒釀酒酵母混合發酵，酒精度較前兩者高，感官評定結果好，蘋果香味濃，尤其是J-4號菌，綜合評定得分最高，確定出J-4號菌為蘋果酒釀造的最佳產香酵母。

表2 蘋果酒評定結果Table 2 Evaluation result of cider

2.4 J-4菌分子鑒定結果

分子測序結果：

5′-GGGATGGCATCTACTGATTTGAGGTCAACTT GATGATATTAAAAGCAACCCTTTGCCTAAGGTACAT TACCATTTCCCTTGTAAAGTAAAACGAATAAATCCA TAAATACATCACAGCGAGAACAGCGTCTCCAAAGA AGCTAAGTGTTGAATTAAAAAAGACTGAAACAGTC TCCAATTTCAAGCTAACCCTGAGTATCGCCCACAAC CAAAAGTTAATAAATTATCTTTTGAGAAGGAAATG A CGCTCAAACAGGCATGCCCCTGAGAATGCTCAAG GGCGCAATGTGCGTTCAAAAATTCAATGATTCACGA GTATCTGCAATTCACATTACTTATCGCAATTCGCTA CGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTG TTGAAAGTTTTAAATTATTT TAAAATTTCCGTTAGG AATTTTGGTTTAGTTTAAAAAATATAATAAAATATA ACTGTTTGTGTTTGTTTTTTGCCTTGAACCTTTCGAT TCAAAGCAGAAAGAATTAAATTAAAGTAAAAAACT CCAATGGGGG-3′。

根據測序結果和NCBI數據庫檢索可知：J-4號菌，其序列與Genebank上Hanseniaspora thailandicaAB501147.1相似度達到99%，認定該菌為孢漢遜酵母屬。本屬的真菌有別于其他酵母菌的主要特征，發酵力強，產酯香良好，可增加釀造產品的風味[11]。

3 結論

通過初篩、復篩，獲得1株適用于蘋果酒發酵用的產香酵母J-4。經初步的發酵試驗綜合評價，J-4號菌是適合蘋果酒釀造的產香酵母。分子測序結果顯示，該菌屬于孢漢遜酵母屬。對菌株J-4進行蘋果酒發酵的工藝條件，如釀酒酵母的添加量及兩者最佳比例、糖濃度、發酵時間、發酵速度、降糖能力、產酒精能力及溫度等一系列的研究將在后續試驗中繼續進行，從而為完善我國蘋果酒釀造工藝及釀造菌種提供依據。

[1]張光杰，王 聰.低醇蘋果酒的研制[J].釀酒，2010，37（3）：78-79.

[2]汪立平，徐 巖.混菌發酵對蘋果酒香氣物質及發酵效率的影響[J].食品科技，2005，26（10）：151-155.

[3]楊曉英，丁立孝，梁美霞，等.蘋果酒優良酵母菌株篩選[J].青島農業大學學報：自然科學版，2008，29（2）：99-101.

[4]于愛梅，徐 巖，王 棟，等.發酵原料對蘋果酒揮發性香氣物質影響的分析[J].中國農業科學，2006，39（4）：786-791.

[5]周靜芳，肖冬光，許引虎，等.蘋果酒發酵中酵母菌株的篩選[J].釀酒科技，2006，8：31-34.

[6]楊振華，張靠穩，馬愛瑛.賀蘭山紫蘑菇基因組DNA 提取方法研究[J].安徽農業科學，2010，38（20）：10557-10559.

[7]WHITE T J,BRUNS T,LEE S,et al.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M].New York:Academic Press Inc,1990.

[8]衛春會，黃治國，羅惠波，等.干型蘋果酒發酵工藝條件的優化[J].現代食品科技，2013，29（2）：367-371.

[9]全國食品工業標準化技術委員會釀酒分技術委員會.GB/T15038—2006 葡萄酒、果酒通用分析方法[S].北京：中國標準出版社，2006.

[10]ZHANG H,ZHOU F,JI B P,et al.Determination of organic acids evolution during apple cider fermentation using an improved HPLC analysis method[J].Eur Food Res Technol,2008,227:1183-1190.

[11]李劍芳，張 灝，厲 凡.獼猴桃之中產香酵母的分離、鑒定及生長特性[J].無錫輕工大學學報，2000，19（4）：345-348.

[12]馬兆瑞，祝占斌，張坐省.不同加糖方式和加糖量對蘋果酒風味的影響[J].釀酒，2003，30（4）：89-90.

[13]彭幫柱，岳田利，袁亞宏.定向選育氨基酸營養缺陷型蘋果酒酵母突變株的研究[J].西北農林科技大學學報，2007，35（4）：96-98.

[14]魏永春，茍斌全，張志良.蘋果酒發酵工藝研究[J].廣東化工，2011，213（1）：32-34.

[15]楊 輝，張智維.蘋果酒發酵條件的研究[J].釀酒，2004，31（5）：72-74.

[16]屈勤兵.蘋果酒的研制[D].青島：青島科技大學碩士論文，2011.

[17]胡月英，陳文學，仇厚援，等.菠蘿果酒酵母的分離及篩選[J].釀酒科技，2009，185（11）：21-23.

[18]張陳云，劉金福，王 娜，等.冬棗果酒釀造酵母的分離篩選研究[J].中國釀造，2010，29（8）：43-46.