甘蔗果酒釀造酵母篩選及其發(fā)酵特性研究

李秀萍，鄭 平，吳幼茹，鄒 毅，李 楠*

（1.廣西大學 生命科學與技術學院，廣西 南寧 530004；2.廣西大學 糖業(yè)工程技術研究中心，廣西 南寧 530004）

廣西是我國最大的甘蔗種植地，擁有非常豐富甘蔗資源。甘蔗制糖為傳統(tǒng)甘蔗產業(yè)，目前為了提高甘蔗產業(yè)鏈，增加甘蔗工業(yè)產值，可以利用甘蔗豐富的糖分和富含人體非常有益的維生素、礦物質元素及氨基酸等營養(yǎng)物質，發(fā)酵生產具有獨特、濃郁甘蔗清香的果酒[1]。甘蔗果酒的釀造關鍵在于發(fā)酵菌株的篩選，而甘蔗生產酒精所選用的酵母發(fā)酵性能直接影響到果酒的風味。本實驗利用甘蔗蔗汁分別以現有的4株釀酒酵母進行酒精發(fā)酵試驗，篩選出1株適宜甘蔗酒釀造的釀酒酵母，同時對優(yōu)選酵母耐性及發(fā)酵溫度、pH進行相關分析，以便有效地將該酵母應用于實際生產，推動甘蔗果酒產業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘蔗汁：廣西農業(yè)科學院實驗基地提供甘蔗自行壓榨蔗汁及廣西南寧糖業(yè)股份明陽糖廠提供。

菌株：4株酵母菌（廣西大學生命科學與技術學院朗姆酒研發(fā)實驗室自選），分別為：1308，1042，31105和32481。

硫酸銨（分析純）、磷酸二氫鉀（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；氧化鈣（分析純）：南京化學試劑有限公司；濃硫酸（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；95%乙醇（分析純）：廣東光華科技股份有限公司。

斜面培養(yǎng)基、平板培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基[2]；種子培養(yǎng)基采用甘蔗汁液體培養(yǎng)基，將甘蔗汁的初糖濃度調整到13°Bx，添加0.2%（NH4）2SO4及0.6%KH2PO4，用濃硫酸調節(jié)pH至4.0；發(fā)酵培養(yǎng)基：甘蔗汁液體培養(yǎng)基，根據實驗需要調節(jié)甘蔗汁的糖度，添加0.2%（NH4）2SO4及0.6%KH2PO4，用濃硫酸調節(jié)至適宜pH值。

所有培養(yǎng)基在121 ℃、20 min條件下滅菌，冷卻備用。

1.2 儀器與設備

RE301型旋轉蒸發(fā)儀：重慶雅瑪拓科技有限公司；ZH WY-211B新型大容量全溫度恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智誠分析儀器制造有限公司；Sup-250生化培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設備有限公司；PAL迷你數顯折射計：廣州市愛宕科學儀器有限公司；酒精計：余姚儀表二廠有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 甘蔗果酒的制備

選取新鮮甘蔗，壓榨，紗布過濾，得蔗汁置于80 ℃水浴保溫30 min，加入新配制石灰乳調節(jié)pH值至7.0，靜置取其上清液，根據實驗需要濃縮甘蔗汁至適宜糖度，添加0.2%（NH4）2SO4及0.6%KH2PO4，用濃硫酸調節(jié)至適宜pH值，以300 mL/500 mL的裝液量裝入三角瓶中，按體積分數10%的菌種量接種到甘蔗汁發(fā)酵液中進行發(fā)酸制備甘蔗果酒。

1.3.2 選育酵母產酒精性能的測試

甘蔗汁糖度自然，調節(jié)初始pH值為4.0，按體積分數10%的菌種量將酵母種子培養(yǎng)液接種到甘蔗汁液體發(fā)酵液中，28 ℃靜置發(fā)酵7 d，分別測定發(fā)酵液中的酒精和殘?zhí)呛浚鶕凭a量、出酒率、發(fā)酵效率、糖利用率確定1株適宜利用甘蔗汁發(fā)酵的釀酒酵母。

1.3.3 繪制優(yōu)選酵母生長曲線及測定不同生長時間甘蔗汁

糖度的變化

按體積分數1%接種量將優(yōu)選酵母接種至以50 mL/150 mL裝液量的種子培養(yǎng)基中，于28 ℃、140 r/min條件下振蕩培養(yǎng)36 h，每隔2 h取培養(yǎng)液稀釋至合適倍數，并以未接種的甘蔗汁液體培養(yǎng)基作為空白對照，測定其OD560nm值[3]，同時對甘蔗汁培養(yǎng)液不同培養(yǎng)時間進行殘?zhí)菧y定。以OD560nm值及殘?zhí)呛繛榭v坐標，培養(yǎng)時間為橫坐標，繪制優(yōu)選酵母生長曲線及不同生長時間甘蔗汁糖度的變化情況。

1.3.4 優(yōu)選酵母抗性試驗測試

（1）耐酒精性能試驗

按表1調節(jié)培養(yǎng)液乙醇體積分數分別為12%、14%、16%、18%、20%，以10%的接種量將種子液接入不同乙醇含量的培養(yǎng)液中，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后，取培養(yǎng)液稀釋液涂布平板檢測培養(yǎng)液中的酵母數，比較酵母數確定優(yōu)選酵母的耐酒精性能[4]。

表1 耐酒精度實驗培養(yǎng)液配比Table 1 Broth ratio of alcohol tolerance test

（2）耐糖性能試驗

將甘蔗汁濃縮，調整初始糖度分別為16°Bx、18 °Bx、20 °Bx、22 °Bx、24 °Bx、26 °Bx、28 °Bx、30 °Bx、32 °Bx、34°Bx、36°Bx、38°Bx，調節(jié)pH值至4.5，以300mL/500 mL的裝液量裝入三角瓶中，按體積分數10%菌種量接入，在28 ℃、140 r/min條件下振蕩培養(yǎng)19 h酵母種子培養(yǎng)液，置于28 ℃靜置發(fā)酵7 d后，測定發(fā)酵液中的乙醇和殘?zhí)呛浚ㄟ^最終的酒精度和殘?zhí)谴_定優(yōu)選酵母的耐糖性能。

1.3.5 優(yōu)選酵母最適發(fā)酵溫度和初始pH的確定

（1）最適發(fā)酵溫度

調整甘蔗汁糖度為26 °Bx，調節(jié)初始pH值為4.5，按10%菌種量接入，在28 ℃、140 r/min條件下振蕩培養(yǎng)19 h的酵母種子培養(yǎng)液，分別置于22 ℃、25 ℃、28 ℃、31 ℃、34 ℃靜置發(fā)酵發(fā)酵7 d后，測定發(fā)酵液中的酒精和殘?zhí)呛俊?/p>

（2）最適發(fā)酵初始pH

調整甘蔗汁糖度為26°Bx，用濃硫酸調節(jié)初始pH值分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，按體積分數10%菌種量接入，在28 ℃、140 r/min條件下振蕩培養(yǎng)19 h酵母種子培養(yǎng)液，置于28 ℃靜置發(fā)酵7 d后，測定發(fā)酵液中的酒精和殘?zhí)呛俊?/p>

1.3.6 分析方法

總糖含量的測定采用手持式折光儀法；酒精度的測定采用酒精計法[5]；酵母數目的測定采用計數法[6]。糖利用率、出酒率、發(fā)酵效率計算公式如下[7]：

2 結果與分析

2.1 不同釀酒酵母產酒精能力的比較

釀酒酵母品種繁多，性能各異，不同酵母菌株的代謝過程有差異，對可發(fā)酵性糖的利用程度不同，而酵母本身的性能是影響果酒品質的重要因素，其選擇會導致最終發(fā)酵酒精生成率有較大差別，也直接影響了果酒的感官和理化品質[8]。甘蔗果酒生產中，酒精是酵母利用發(fā)酵性糖而產生的，因此把利用發(fā)酵性糖發(fā)酵生成酒精的能力作為衡量優(yōu)良酵母的一項重要指標[9]，各酵母菌株的發(fā)酵產酒及發(fā)酵液中殘?zhí)呛壳闆r分別見圖1和圖2。

由圖1可知，發(fā)酵結束后，菌株32481乙醇最高，發(fā)酵液中殘?zhí)呛孔畹停罱K乙醇含量達到12.6%（V/V）；由圖2可知，菌株32481發(fā)酵出酒率為42.48%，發(fā)酵效率為83.13%，糖的利用率42.48%，在4株釀酒酵母中均為最高。以上實驗說明菌株32481發(fā)酵能力較強、產酒精的能力最好，因此，確定了菌株32481為最佳甘蔗果酒發(fā)酵酵母。

圖1 不同釀酒酵母產酒精能力及殘?zhí)呛縁ig.1 Different Saccharomyces cerevisiae alcohol production capacity and residual sugar content

圖2 不同釀酒酵母發(fā)酵出酒率、發(fā)酵率、糖利用率情況Fig.2 Different yeast fermentation alcohol yield,fermentation rate and sugar utilization situation

2.2 優(yōu)選酵母生長曲線的測定及不同生長時間甘蔗汁糖度的變化

圖3 酵母菌生長曲線及不同生長時間甘蔗汁糖度的變化情況Fig.3 Yeast growth curve and change of sugarcane juice sugar content in different growth period

隨著酵母菌的生長，甘蔗汁培養(yǎng)液的營養(yǎng)被消耗，發(fā)酵液中的糖逐漸被轉化為酒精，導致甘蔗汁的糖度逐漸降低。由圖3可以看出，優(yōu)選酵母的生長曲線符合“S”型生長模型，在接種初期0～8 h，為酵母生長延遲期，在這一階段，酵母數目及甘蔗汁培養(yǎng)基中的殘?zhí)呛孔兓淮螅L速率幾乎為零；8～18 h為酵母生長對數生長期，這一階段酵母代謝旺盛、大量繁殖，酵母數目迅速增加，培養(yǎng)基中的殘?zhí)呛恳惭杆俳档停L速率達到最大；培養(yǎng)至18 h后酵母細胞生長進入穩(wěn)定期，由于各種理化條件逐漸不適宜酵母生長，此時活細胞數及培養(yǎng)基中殘?zhí)呛勘３窒鄬Ψ€(wěn)定。因此，在進行酒精發(fā)酵時選擇19 h為酵母種子的接種齡接種至甘蔗汁發(fā)酵培養(yǎng)基中進行酒精發(fā)酵。

2.3 耐性試驗

2.3.1 耐酒精性能試驗

酒精生產過程中，由于酒精度的提高可以降低蒸餾時的能耗，發(fā)酵時應盡可能地提高成熟醪的酒精度，而酒精含量對酵母菌的生長影響很大[10]，過高的乙醇含量對酵母本身具有毒性，破壞細胞膜結構和功能，能抑制酵母細胞的生長及繁殖能力，從而殺死酵母，因此要求生產中的酵母要具備一定的耐受酒精的能力[11-12]。

表2 優(yōu)選酵母對酒精的耐受能力Table 2 Alcohol tolerance ability of preferred yeast

從酵母細胞數可以確定菌株的耐乙醇特性。由表2可以看出，隨著起始乙醇體積分數的增大，各菌株培養(yǎng)液的酵母細胞數呈下降的趨勢。起始的乙醇含量為12%vol～14%vol時，對各菌株生長影響不大，酵母均可正常生長繁殖；乙醇含量在16%vol～18%vol范圍內，酵母菌的生長量明顯減少，培養(yǎng)液的酵母細胞數下降均＞50%；乙醇含量＞18%vol后，酵母基本停止生長，表明20%vol乙醇含量對各菌株生長有較明顯的抑制作用。因此，可以確定優(yōu)選酵母能夠耐受乙醇含量最高為18%vol。

2.3.2 耐糖性能試驗

總糖含量是影響酒精發(fā)酵的重要因素，但隨著總糖含量的增加，酵母的生長和發(fā)酵會受到一定的抑制，當總糖含量＞270 g/L時，高濃度的糖導致滲透壓增加，抑制細胞活性，酵母生長及酒精發(fā)酵緩慢而且糖利用率較低，從而影響最終發(fā)酵效果[13]。

由圖4可知，高濃度的總糖可產生高濃度的酒精，隨著初始糖度的不斷升高，優(yōu)選酵母的生長和發(fā)酵逐漸受到一定的抑制，發(fā)酵液中的殘?zhí)呛恳搽S之升高，發(fā)酵液中糖利用率、出酒率、發(fā)酵效率不斷降低。在初始糖濃度為16～26°Bx時，優(yōu)選酵母可以正常生長，酒精發(fā)酵沒有影響，并且隨著初始糖度的增加，酒精發(fā)酵逐漸增強，在初始糖度為26°Bx時，發(fā)酵液中酒精含量最高；初始糖度＞36°Bx時優(yōu)選酵母活力迅速降低，酒精發(fā)酵能力受到抑制。因此根據表7可以確定該優(yōu)選酵母最高耐受糖濃度為36°Bx，說明該菌株能耐受較高的滲透壓，有利于今后在高濃度酒精發(fā)酵工藝中應用。

圖4 優(yōu)選酵母對糖度的耐受能力Fig.4 Sugar tolerance ability of preferred yeast

2.4 優(yōu)選酵母最適發(fā)酵溫度和pH值的確定

2.4.1 優(yōu)選酵母最適發(fā)酵溫度的確定

溫度是影響酵母生長繁殖和發(fā)酵作用的一個重要因素[14]。由圖5可知，溫度過低或過高均不利于優(yōu)選酵母進行酒精發(fā)酵，其中，當發(fā)酵溫度為28 ℃時，酒精度達到最高，糖利用率、出酒率、發(fā)酵效率最高，故確定優(yōu)選的最適發(fā)酵溫度為28 ℃。

圖5 發(fā)酵溫度對甘蔗汁酒精度的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on sugar cane juice alcohol content

2.4.2 優(yōu)選酵母最適發(fā)酵初始pH值的確定

圖6 初始pH值對甘蔗汁酒精度的影響Fig.6 Effect of initial pH on sugar cane juice alcohol content

pH對酵母代謝有很大的影響，能夠影響細胞吸收營養(yǎng)物質的能力及其生物酶活性[15]。由圖6可知，過高或過低的pH會抑制酵母細胞酶的活性及阻礙新陳代謝，使得酵母繼續(xù)生長受阻，從而影響最終發(fā)酵能力，其中，當初始pH值為4.5時，酒精產量達到最高，糖利用率、出酒率、發(fā)酵效率最高，故確定優(yōu)選酵母的最適發(fā)酵初始pH值為4.5，此時甘蔗果酒的酒精度為13.4%vol，糖利用率為60.38%，出酒率為40.66%，發(fā)酵效率為79.58%。

3 結論

對供試4株酵母發(fā)酵特性的對比研究結果表明，各酵母在甘蔗汁中產酒精能力大小排序為32481＞31105＞1043＞1308，確定了菌株32481為最佳甘蔗果酒發(fā)酵酵母；在酒精發(fā)酵過程中，溫度、pH值、酒精含量、底物濃度對酵母發(fā)酵性能影響較大。實驗結果表明，優(yōu)選酵母最高能夠耐受乙醇含量18 %vol、耐受糖濃度為36 °Bx，最佳發(fā)酵初始糖度為26°Bx；最適的發(fā)酵溫度為28 ℃、初始pH值為4.5。在此發(fā)酵條件下，甘蔗果酒的酒精度達到13.4%vol，糖利用率為60.38%，出酒率為40.66%，發(fā)酵效率為79.58%。優(yōu)選酵母具有產酒率高、耐酒精及耐高糖性能等特點，發(fā)酵所得原酒色澤金黃透亮，果香、酒香濃郁、協調。但是，為了使該菌株能夠推廣應用，仍需對菌株的其他特性和發(fā)酵工藝進行深入研究。

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