梔子苷的精制純化研究

蔣 威，徐 旭，景艷艷，楊 贊，方尚玲*

（湖北工業大學 生物工程學院 工業發酵湖北省協同創新中心 發酵工程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068）

梔子是茜草科（Rubiaceae）梔子屬（Gardenia）植物，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒的作用，外治扭挫傷[1-2]。近年來對梔子苷的研究表明，其在消化系統、心血管系統、中樞神經系統及抗炎、抗腫瘤、降血糖方面具有廣泛的藥理作用[3-6]。

大孔吸附樹脂是一類不帶離子交換基團的多孔性交聯聚合物吸附劑，具有良好的大孔網狀結構和較大的比面積，對化學物質的分離作用主要由其吸附選擇性產生，對單味中藥提取物中苷類成分、黃酮、生物堿的分離效果良好，有的已經實現工業化生產[7-9]。

目前，梔子中梔子苷的提取和純化方法多為水提醇沉法。本實驗以提取梔子黃之后的廢液為原料，利用大孔吸附樹脂富集，以較簡便的方法得到較高純度的梔子苷產品，有利于工業化大規模生產。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梔子：市售；梔子苷廢液：利用梔子果提取梔子黃時產生的廢液；梔子苷對照品：中國生物制品檢定所，批號20 140122；大孔樹脂X-5、AB-8、HPD-400、D3520、D1300、NKA：鄭州勤實科技有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UV-2201PC型紫外-可見分光掃描儀：日本島津公司；EV-201旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 樹脂靜態吸附實驗

（1）樹脂的預處理

樹脂預處理方法見參考文獻[10]。

（2）靜態吸附實驗

靜態吸附實驗見參考文獻[11]。

靜態吸附實驗吸附率及解吸率的計算公式為：

式中：A1為吸附前梔子苷粗提液在238 nm處的吸光度值，A2為吸附平衡后梔子苷粗提液在238 nm處的吸光度值，A3為解吸后體積分數30%乙醇中梔子苷粗提液在238 nm處的吸光度值。

1.3.2 樹脂動態吸附實驗

（1）樹脂的預處理

樹脂預處理方法同上。

（2）動態吸附流速確定研究

分別以1.0 mL/min、1.5 mL/min、2.0mL/min、2.5mL/min、3.0 mL/min的流速進行動態吸附。當達到吸附平衡時，流出液的吸光度值不再變化，記錄上樣液和流出液體積，測定總流出液和樣液的吸光度值，吸附量計算公式如下：

式中：V樣為上樣液體積，mL；V流流出液體積為，mL；A流為總流出液的吸光度值；A樣為樣液的吸光度值；V柱為樹脂床體積，mL。

（3）不同濃度梔子廢液對樹脂吸附率的研究

各取120 mL（3BV）不同濃度梔子苷廢液（稀釋5、10、15、20、25倍）上柱，確定流速動態吸附，分別收集流出液，在238 nm波長處測定吸光度值A238nm，確定最佳梔子苷廢液濃度，吸附率計算公式如下：

式中：A0為梔子苷上樣液238 nm處吸光度值，V0為上樣體積，mL；A1為流出液在238 nm處吸光度值，V1為流出液體積；mL。

（4）泄漏曲線的繪制

上述條件下將梔子廢液上柱吸附，每20 mL流出液收集一份，以每份流出液在238 nm波長處的吸光度值為縱坐標，以流出液編號為橫坐標，繪制泄漏曲線。

1.3.3 動態洗脫實驗

（1）不同體積分數乙醇對樹脂的影響

分別用不同體積分數的乙醇對吸附飽和的樹脂進行洗脫，每20 mL流出液收集一份，分別測定其在238 nm波長處的吸光度值A238nm，以流出液的編號為橫坐標，以每份流出液在238 nm波長處的吸光度值為縱坐標，繪制不同體積分數乙醇洗脫曲線。

（2）不同流速對樹脂洗脫的影響

以確定乙醇體積分數作為洗脫劑，分別采用不同的流速對梔子苷洗脫，實驗步驟同上，繪制不同流速洗脫曲線。

（3）動態洗脫曲線的繪制

以確定上樣液濃度，流速，吸附量條件下得到已經飽和樹脂，再以上述確定洗脫流速，用2BV去離子水除去水溶性雜質，用確定乙醇體積分數進行洗脫，實驗步驟同上，繪制動態洗脫曲線。收集同一吸收峰吸光度值高的各管洗脫液，分別合并，減壓濃縮、真空干燥，測定梔子苷的含量。

1.3.4 梔子苷的濃縮與干燥

文言文教學固然存在或多或少的問題。如何認清問題的存在，很好地解決問題是當下急需重視的內容。只有解決好這些問題，才能更好地指導文言文教學實踐。

（1）真空蒸發濃縮

使用旋轉蒸發儀將精制后的梔子苷減壓濃縮除去大量乙醇和部分水分。

（2）低溫干燥

將濃縮后的梔子苷置于50 ℃干燥箱內24 h，得淡黃色粉末梔子苷。

1.3.5 梔子苷含量的測定

（1）標準曲線的制作

采用紫外分光光度法，精密稱取梔子苷對照品5.1 mg，溶解于體積分數為95%乙醇中，定容于25 mL容量瓶中，精密移取0、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL于10 mL容量瓶中，分別加體積分數為95%乙醇稀釋定容至刻度，以體積分數為95%乙醇為空白，于238 nm波長處測定吸光度值A238nm，繪制標準曲線，得線性回歸方程[12]。

（2）樣品測定

2 結果與討論

2.1 靜態吸附樹脂篩選實驗

以不同樹脂對梔子苷不同的吸附率和解吸率為標準，篩選對其吸附能力及解吸能力強的樹脂，選擇6種樹脂進行實驗，結果如表1所示。

表1 不同型號大孔吸附樹脂對梔子苷的吸附解吸性能比較Table 1 Absorption and desorption performance of different types of macroporous resin for gardenoside

由表1可知，D1300樹脂吸附率和解吸率均大于其他樹脂，因此，在后續研究中確定D1300型大孔吸附樹脂對梔子苷進行精制純化。

2.2 動態吸附最佳條件的確定

2.2.1 不同流速對樹脂吸附量的影響

分別以1.0 mL/min、1.5 mL/min、2.0 mL/min、2.5 mL/min、3.0 mL/min的流速進行動態吸附，流速對樹脂吸附量的影響結果見圖1。

圖1 流速對樹脂吸附量的影響Fig.1 Effects of sample velocity on adsorption capacity

由圖1可知，隨著流速的增加，樹脂吸附量逐漸降低，不利于樹脂的吸附。雖然流速為1.0 mL/min時，樹脂的吸附量最大，但是低流速會延長吸附時間，同時滯留在樹脂中的雜質也會增多；而高流速下樹脂吸附量下降太快，綜合考慮，確定1.5 mL/min為最佳吸附流速。

2.2.2 上樣液濃度對樹脂吸附率的影響

以1.5mL/min為吸附流速，各取120 mL（3BV）不同濃度梔子苷廢液（在238 nm處吸光度值分別為1.372 9、1.683 0、2.293 0、3.150 3上柱，上樣液濃度對樹脂吸附量的影響結果見圖2。

圖2 上樣液濃度對樹脂吸附率的影響Fig.2 Effects of sample concentration on adsorption rate

由圖2可知，梔子苷濃度越低越利于吸附，但是濃度過低，樹脂吸附雜質越多，增加了分離難度。當梔子苷廢液吸光度值A238nm=1.683時，樹脂吸附率降低幅度不大，故選擇梔子苷廢液吸光度值A238nm=1.683作為最佳上樣液濃度。

2.2.3 吸附泄漏曲線的制作

以1.5 mL/min為吸附流速，以梔子苷廢液吸光度值A238nm=1.683為樣液濃度上柱吸附，每20 mL流出液收集一份，以每份流出液在238 nm波長處的吸光度值為縱坐標，以流出液編號為橫坐標，吸附泄漏曲線見圖3。

圖3 梔子苷的吸附泄露曲線Fig.3 Leakage adsorption curve of geniposide

由圖3可知，當收集到第12份時，梔子苷開始泄露，所以梔子苷廢液（A238nm=1.683）的飽和吸附容量為12×20 mL，即12 BV（樹脂柱體積為20 mL）。

2.3 最佳洗脫條件的確定

2.3.1 不同體積分數乙醇對樹脂洗脫的影響

不同體積分數乙醇對樹脂洗脫的影響結果見圖4。

圖4 洗脫劑乙醇體積分數對洗脫率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on elution rate

由圖4可知，體積分數為40%、50%乙醇洗脫效果最好，體積分數為30%乙醇其次，體積分數為10%、20%乙醇洗脫效果最差。但是乙醇體積分數過高，會將梔子廢液中的梔子色素洗脫下來[13-15]，且體積分數為40%，50%乙醇洗脫時存在拖尾現象，而體積分數為30%乙醇洗脫曲線窄，不存在拖尾現象，故選擇體積分數為30%乙醇作為洗脫劑。

2.3.2 不同流速對樹脂洗脫的影響

以體積分數30%的乙醇作洗脫劑，分別以1.0 mL/min、1.5 mL/min、2.0 mL/min、2.5 mL/min、3.0 mL/min的流速進行動態洗脫實驗。流速對樹脂洗脫的影響結果見圖5。

由圖5可知，低流速有利于梔子苷的洗脫，但低流速洗脫時所花時間也越長，同時增加了洗脫液中的雜質；流速過高，洗脫劑與樹脂接觸不完全，洗脫效果差，綜合考慮，選擇2 mL/min為最適洗脫速率。

圖5 洗脫流速對洗脫率的影響Fig.5 Effect of elution rate on elution rate

2.3.3 動態洗脫曲線的繪制

以1.5 mL/min為吸附流速，以梔子苷廢液吸光度值A238nm=1.683為樣液濃度上柱吸附，得到飽和樹脂；再以2 mL/min洗脫流速，用2BV去離子水除去水溶性雜質，用體積分數30%乙醇進行洗脫，動態洗脫曲線見圖6。

圖6 動態洗脫曲線Fig.6 Dynamic elution curve

由圖6可知，梔子苷洗脫高峰相對集中，體積分數為30%乙醇2.5～6.5 BV時，梔子苷含量最高，當洗脫液＞7.0 BV時，梔子苷含量明顯減少。收集體積分數為30%乙醇2.5～6.5 BV洗脫液，減壓濃縮，真空干燥，得到精制梔子苷。

2.4 梔子苷含量的測定

2.4.1 標準曲線的制作

采用紫外分光光度法，于238 nm 波長處測定吸光度值繪制標準曲線，得線性回歸方程y=9.670 4x+0.038 9，相關系數R2=0.990 6，表明線性關系良好。

2.4.2 樣品測定

精密稱取5.1 mg干燥的樣品（經大孔樹脂吸附、洗脫、濃縮、干燥后的梔子苷粉末），置于25 mL量瓶中，用體積分數為95%乙醇溶解，并定容到25 mL容量瓶中，精確吸取1 mL于10 mL容量瓶中，加體積分數為95%乙醇定容至刻度，以體積分數為95%乙醇作為空白，于238 nm波長處測吸光度值為0.436 5，計算得到梔子苷粉末中梔子苷含量為82.23%。

3 結論

根據以上研究和分析，確定梔子苷精制樹脂的最佳條件：大孔吸附樹脂選擇D1300，上樣液梔子苷廢液的吸光度值A238nm為1.683 0，吸附流速為1.5 mL/min，吸附飽和量為12BV，洗脫流速為2 mL/min，梯度洗脫，2BV水洗，4BV體積分數為30%乙醇洗脫。收集體積分數為30%乙醇洗脫液，濃縮干燥后得到純度為82.23%的固態梔子苷產品。該實驗方法簡單，材料便宜，產品純度比較高，適合工業化生產。大孔樹脂吸附純化的工藝參數較多，如樣液上柱前的凈化方法、樹脂徑高比等有待進一步研究。

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