海洋枝頂孢霉BH0531代謝物對(duì)松材線蟲形態(tài)和酶活的影響

杜海霞，蒙春蕾，王勇勇，孟慶恒，2 *，孫建華，2

（1.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

全球每年因植物寄生線蟲造成的損失達(dá)1 570億美元[1]，我國(guó)每年有超過5 000萬(wàn)株松樹死于松材線蟲病，松材損失超過500萬(wàn)m3，年均發(fā)生面積近6萬(wàn)hm2，研究和開發(fā)高效的殺線蟲制劑迫在眉睫[2]。真菌資源作為生物防治線蟲的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域[3]，已從700多種殺線活性菌株中分離獲得殺線活性物質(zhì)230余種[4-5]。

枝頂孢霉屬（Acremonium）是已知的具有殺線蟲活性的種屬之一，該屬約有130余種，主要營(yíng)腐生、植物寄生和自生，具有豐富的遺傳和生態(tài)多樣性[6-7]，特別是陸生性菌種有許多已被證實(shí)具有殺線蟲活性[8]，如頂孢霉（A.coenophialum）能夠降低短體線蟲（Pratylenchus scribneri）和矮化線蟲（Tylenchorhynchus acutus）蟲口密度[9]；枝頂孢霉（A.stricturn）能夠破壞甜菜胞囊線蟲（Heterodera schachtii）的卵[10]，抑制大豆胞囊線蟲（H.glycines）和南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）卵的孵化[11]。海洋來(lái)源的枝頂孢霉（Acremoniumsp.BH0531）也被證實(shí)具有明顯的殺線蟲作用，其代謝物具有分子質(zhì)量小、水溶性好和耐熱的特性[12]。在此基礎(chǔ)上，從線蟲的相關(guān)酶學(xué)變化和表觀效應(yīng)的角度對(duì)BH0531代謝物的殺線蟲效應(yīng)進(jìn)行了進(jìn)一步研究，探討該菌對(duì)松材線蟲的可能作用機(jī)理。

乙酰膽堿酯酶（acetylcholin esterase，AChE)存在于大部分脊椎動(dòng)物、昆蟲和線蟲神經(jīng)元內(nèi)，特別是膽堿能神經(jīng)元、神經(jīng)肌肉接頭處和肌肉組織中，能通過將類膽堿神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿催化水解為乙酸和膽堿來(lái)終止神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)突觸后膜的興奮作用，保證神經(jīng)信號(hào)在生物體內(nèi)正常傳遞，是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的一種關(guān)鍵性酶，常被作為神經(jīng)毒劑檢測(cè)的生化標(biāo)志物，在毒理學(xué)研究上十分重要。而ATP酶通過水解ATP為生物體的一切生命活動(dòng)提供能量，機(jī)體在缺氧及一些疾病狀態(tài)下，此酶活力會(huì)發(fā)生一系列改變。因此，本研究對(duì)松材線蟲體內(nèi)與神經(jīng)傳導(dǎo)密切相關(guān)的AChE和與運(yùn)動(dòng)能量代謝有關(guān)的ATP酶比活力進(jìn)行測(cè)定，對(duì)BH0531代謝物的殺線機(jī)理進(jìn)行初步探究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海洋枝頂孢霉（Acremoniumsp.BH0531），菌種保藏號(hào)：CGMCC-5445、灰葡萄孢霉（Batrytis cinerea）：天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室；松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）：中國(guó)農(nóng)科院植保所研究院。

乙酰膽堿酯酶AChE測(cè)定試劑盒、總ATP酶測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

實(shí)驗(yàn)所用主要化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Leica DME光學(xué)顯微鏡：上海徠卡顯微系統(tǒng)有限公司；UV-2550紫外可見分光光度儀：美國(guó)Varian公司；XTB-A5538體視顯微鏡：桂林光學(xué)儀器廠；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HZ-2010K控溫?fù)u瓶柜：上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 BH0531的培養(yǎng)

活化培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g煮汁，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，接種后于26 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)7 d。

發(fā)酵培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯150 g煮汁，葡萄糖10 g，酵母膏1 g，海水600 mL，加蒸餾水定容至1 000 mL。

1.3.2 灰葡萄孢霉菌的培養(yǎng)10 g大麥仁，8 mL去離子水，大試管浸泡3 h，滅菌，接入灰葡萄孢霉，21 ℃下避光培養(yǎng)7 d。

1.3.3 供試線蟲的培養(yǎng)與收集

在長(zhǎng)滿了灰葡萄孢霉的大試管內(nèi)接入大小為1 cm2的松材線蟲塊，25 ℃下避光培養(yǎng)12 d。用貝爾曼漏斗法收集松材線蟲，配制成15 000條/mL的懸液。

1.3.4 發(fā)酵液的制備

取新鮮培養(yǎng)的BH0531菌株斜面，加入無(wú)菌水洗脫孢子，制備成約1×106個(gè)/mL的孢子懸液，以2 mL接種量接入裝有100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，26 ℃條件下，120 r/min振蕩培養(yǎng)4 d。將培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)真空抽濾后，4 ℃下離心（3 000 r/min、20 min），用孔徑為0.22 μm微孔濾膜過濾即為所需的發(fā)酵液部分。

1.3.5 粗酶液制備

將處理線蟲用無(wú)菌水離心洗滌3次（2 000 r/min，3 min/次）后，取蟲體置于預(yù)冷的滅菌勻漿器中，加入2 mL預(yù)冷生理鹽水，冰浴下勻漿15 min，4 ℃離心（3 000 r/min、20 min）取上清即為粗酶液。

1.3.6 生物活性檢測(cè)測(cè)定

鏡檢：以無(wú)菌水為對(duì)照，按照1 500 條/mL發(fā)酵液，分別處理松材線蟲2 h、4 h、8 h、16 h、32 h，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。采用Leica光學(xué)顯微鏡，將不同處理時(shí)間段的線蟲取樣觀察拍照并攝像，每個(gè)時(shí)間段重復(fù)取樣3次，記錄視野范圍內(nèi)線蟲的振幅和扭動(dòng)次數(shù)并計(jì)算頻率。

酶比活力測(cè)定：采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的乙酰膽堿酯酶AChE測(cè)定試劑盒與總ATP酶測(cè)定試劑盒，結(jié)合用UV-2550紫外可見分光光度儀，分別測(cè)定線蟲AChE酶與ATP酶的比活力，具體操作步驟參照劑盒說(shuō)明書。

2 結(jié)果與分析

2.1 BH0531發(fā)酵原液對(duì)松材線蟲形體的影響

線蟲經(jīng)BH0531發(fā)酵原液處理后的形態(tài)觀察結(jié)果如圖1所示。圖1A為對(duì)照組觀察到的活體線蟲，線蟲體態(tài)自然，呈S型，蟲體內(nèi)容物分布均勻，結(jié)構(gòu)完整。經(jīng)BH0531發(fā)酵原液處理16 h后，蟲體體態(tài)嚴(yán)重扭曲、扭結(jié)，呈“&”型（圖1B）或“ω”形（圖1C），少部分蟲體僵直萎縮。處理32 h后，線蟲尾部彎曲成鉤狀（圖1D），個(gè)別蜷縮呈“o”型（圖1E），頭部腫脹（圖1F），最終成C形、新月形或直形死亡（圖1G）。

圖1 BH0531發(fā)酵原液對(duì)松材線蟲形體的影響Fig.1 Effect of BH0531 fermentation broth on the morphology of B.xylophilus

2.2 BH0531發(fā)酵原液對(duì)松材線蟲運(yùn)動(dòng)能力的影響

采用Leica光學(xué)顯微鏡對(duì)測(cè)試線蟲攝像1 min，測(cè)定線蟲每分鐘內(nèi)扭動(dòng)的次數(shù)，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，BH0531代謝物處理線蟲2 h時(shí)，運(yùn)動(dòng)頻率高的線蟲（≥40次/min）所占比例比對(duì)照增加了13.9%，表明經(jīng)代謝物處理后，線蟲運(yùn)動(dòng)加快，處于興奮狀態(tài)。處理8 h后，處理組線蟲開始出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)頻率≤10次/min的線蟲，表明線蟲的運(yùn)動(dòng)受到抑制。16 h后，處理組中高頻率的線蟲全部消失，中頻率線蟲減少為對(duì)照組的61.5%。處理32 h后，處理組的低頻率線蟲為對(duì)照組低頻率線蟲數(shù)量的8.26倍。

圖2 BH0531發(fā)酵原液對(duì)松材線蟲運(yùn)動(dòng)能力的影響Fig.2 Effect of BH0531 fermentation broth on the athletic ability of B.xylophilus

2.3 BH0531發(fā)酵原液對(duì)線蟲體內(nèi)乙酰膽堿酯酶和總?cè)姿嵯佘眨ˋTP）酶的影響

2.3.1 對(duì)線蟲乙酰膽堿酯酶（AChE）比活力的影響

圖3 BH0531發(fā)酵原液對(duì)松材線蟲AChE比活力的影響Fig.3 Effect of BH0531 fermentation broth on AChE activity of B.xylophilus

由圖3可知，松材線蟲乙酰膽堿酯酶對(duì)BH0531代謝物非常敏感，處理4 h內(nèi)，AChE比活力急劇下降，由0.417 U/mg降至0.089 U/mg，僅為對(duì)照組的36.1%。處理后期，處理組線蟲AChE比活力始終低于對(duì)照組，差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，BH0531代謝物對(duì)松材線蟲AChE比活力有強(qiáng)抑制作用，致使線蟲神經(jīng)傳導(dǎo)紊亂，過度興奮，中毒死亡。

AChE在線蟲的體壁肌細(xì)胞、咽肌細(xì)胞、肛門神經(jīng)節(jié)和頭部神經(jīng)元等部位都有表達(dá)，與神經(jīng)遞質(zhì)密切相關(guān)[13-14]。線蟲依靠體壁縱向排列的背肌帶和腹肌帶的收縮而獲得蠕行的動(dòng)力，在線蟲的腹神經(jīng)索和背神經(jīng)索存在神經(jīng)—肌肉突觸，需通過神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿來(lái)調(diào)節(jié)肌肉活動(dòng)[15]。BH0531代謝物對(duì)松材線蟲AChE比活力有強(qiáng)抑制作用，使線蟲神經(jīng)傳導(dǎo)受阻，無(wú)法終止興奮，肌肉痙攣，這與線蟲處理前期扭動(dòng)頻率提升癥狀相符合。

2.3.2 對(duì)線蟲總ATP酶比活力的影響

圖4 BH0531發(fā)酵原液對(duì)松材線蟲ATP酶比活力的影響Fig.4 Effect of BH0531 fermentation broth on ATPase activity of B.xylophilus

由圖4可知，處理組線蟲三磷酸腺苷酶（adenosine triphos phatase，ATPase）在處理前期（2 h），酶比活力由0.447 U/mg升至0.501 U/mg，酶比活力升高了17%，隨著處理時(shí)間的延續(xù)又急劇下降至0.180 U/mg，下降為對(duì)照的59.1%。結(jié)果表明，ATP酶在處理前期（2 h）活力升高是用于滿足線蟲中毒后的信息傳遞和能量轉(zhuǎn)換等要求。隨著線蟲中毒時(shí)間延長(zhǎng)，ATP酶比活力被抑制。

ATP酶存在于線蟲組織細(xì)胞及細(xì)胞器的膜上，在物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換以及信息傳遞方面具有重要作用。BH0531代謝物處理線蟲2 h，線蟲ATP酶比活力顯著升高，可能與線蟲過度興奮，呼吸與代謝加快有關(guān)。隨后，ATP酶活力降低，推測(cè)線蟲由于肌肉麻痹，扭動(dòng)頻率減小，各項(xiàng)機(jī)能減退，所需能量減少。

3 結(jié)論

研究了海洋來(lái)源的枝頂孢霉（Acremoniumsp.BH0531）代謝物對(duì)松材線蟲形態(tài)變化、運(yùn)動(dòng)能力及重要酶類的影響，從線蟲表觀效應(yīng)和酶學(xué)變化等不同角度探究該菌殺線蟲作用的可能機(jī)理，為該菌進(jìn)一步開發(fā)成為植物寄生線蟲生防治劑奠定實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。結(jié)果表明，BH0531代謝物的殺線蟲機(jī)制與有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的機(jī)制類似，AChE可能是BH0531代謝物殺線的靶標(biāo)之一，而ATP酶的變化則可能是由中毒癥狀引發(fā)，并非BH0531代謝物的直接作用靶標(biāo)。

酶活性測(cè)試表明，該菌代謝物對(duì)松材線蟲體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶AChE具較強(qiáng)抑制作用，酶比活力由0.417 U/mg降至0.089 U/mg；ATP酶活力先升高后下降，處理2 h酶比活力由0.447 U/mg升至0.501 U/mg，隨著時(shí)間的持續(xù)又急劇下降至0.180 U/mg左右。這兩種酶活力的變化情況與線蟲處理后運(yùn)動(dòng)頻率變化的觀察結(jié)果相一致。

根據(jù)BH0531殺線活性代謝物水溶性好、分子質(zhì)量小、熱穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，可推斷BH0531代謝物主要?dú)⒕€蟲活性成分可能為含氮糖類或含氮糖類衍生物。由于BH0531代謝物成分尚未確定，殺線機(jī)理尚有待進(jìn)一步深入研究。

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