液化法釀造燕麥黃酒工藝條件優化

劉 浩，任貴興*

（中國農業科學院 作物科學研究所，北京 100081）

燕麥（Avena sativaL.）又名莜麥，為禾本科（Gram-ineae）、早熟禾亞科（Pooideae）、燕麥屬（Avena），一年生草本植物，是古老的飼草、飼料及糧食作物[1-2]。按照外稃的性狀可分為有稃型的皮燕麥與無稃型的裸燕麥兩類，我國以種植裸燕麥為主。燕麥籽粒食用為主，通常認為裸燕麥的營養價值比皮燕麥更高[3]。燕麥是營養與醫療保健價值較高的谷物，蛋白質含量很高，富含可溶性膳食纖維、β-葡聚糖、酚酸、蒽酰胺（avenanthramides）、類黃酮、維生素E等化合物[4]。如此豐富的營養與功能成分使得燕麥及其制品有多種生物活性，如降血脂[5]、降血糖[6]、抗氧化[7]、免疫增強[8]等。燕麥食用加工歷史悠久，主要是以燕麥谷物早餐等形式出現[1]。在我國，大部分燕麥用于制粉，進而制作燕麥傳統食品（如莜面、栲栳栳）、燕麥面包與餅干[9]等。近年來含有或使用燕麥作為主要原料制作的谷物飲料、豆漿、酸奶等飲品也有出現[10-12]。

黃酒釀造歷史悠久，傳統釀造工藝歷經幾千年的不斷改進和完善已達到很高的水平，但仍然存在生產周期長、原料利用率不高、人工勞動強度大等缺點。黃酒釀造新工藝在傳統工藝的基礎上進行改進。液化法是黃酒釀造新工藝的其中一種，基本過程是將原料粉碎后使用酶制劑和微生物進行液化、糖化、發酵，該工藝對于原料的選擇范圍更廣、利用率更高，此外還具有醪液流動性可控、易于機械化生產等優點[13-14]。液化法用于雜糧酒釀造已有相關報道，如苦蕎酒[15]、薏米酒[16]、紫薯酒[17]等。

本研究以炒制并磨碎的裸燕麥為原料，以葡萄糖當量值、還原糖含量、固形物含量等作為綜合評價指標，通過單因素試驗與正交試驗對液化法釀造燕麥黃酒的液化、糖化、主發酵工藝條件進行優化，旨在為燕麥黃酒的工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

裸燕麥：取自河北省張家口市農業科學院；耐高溫α-淀粉酶（40 000 U/g）、糖化酶（100 000 U/g）均為食品級：江蘇瑞陽生物科技有限公司；黃酒活性干酵母、甜酒曲：安琪酵母股份有限公司；氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉均為分析純：西隴化工股份有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、無水亞硫酸鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；重蒸酚、葡萄糖（分析純）：上海Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

GTJ-368滾筒式電加熱炒貨機：青島德維機械制造有限公司；WK-400A試驗室小型高速粉碎機：山東青州精誠機械有限公司；PB602電子天平（感量0.01 g）、PB203電子天平（感量0.001 g）：METTLER TOLEDO集團；3FG-01B電熱恒溫干燥箱：湖北省黃石市醫療器械廠；TD25-WS多管架自動平衡離心機：湘儀離心機儀器有限公司；4802UV/VIS分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；RP-300B人工氣候箱：中國南京恒裕電子儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 分析方法

還原糖的測定采用DNS法[18]：待測液4 500 r/min離心5 min，取上清液稀釋至適宜倍數待測；葡萄糖標準曲線的制備，配制不同葡萄糖含量的反應液，再加入3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑3.5 mL，輕搖混勻，沸水浴10 min顯色，冷卻后用純凈水定容至20 mL，顛倒混勻。在波長540 nm處比色，以去離子水為空白，測出各管的吸光度值。以吸光度值為縱坐標，葡萄糖含量為橫坐標，繪制葡萄糖標準曲線，得到回歸方程，計算還原糖含量。

固形物含量的測定參照GB/T 13662—2008《黃酒》中總固形物的測定方法執行，略有改動。吸取稀釋至合適倍數的試樣5 mL于已知干燥至質量恒定的蒸發皿中，放入（103±2）℃的電熱干燥箱中烘干4 h，取出稱質量（g），按照下式計算固形物含量。

葡萄糖當量值（dextrose equivalent，DE）值[19]的計算公式：

酒精度、非糖固形物、總糖、總酸、氨基酸態氮、pH值、氧化鈣、β-苯乙醇、鉛、微生物含量的測定均按照GB/T 13662—2008《黃酒》中的測定方法執行。

1.3.2 傳統方法與液化方法釀造燕麥黃酒對比試驗設計

分別采用北方黃酒傳統釀造工藝與液化工藝進行初步試驗，選取籽粒飽滿、無霉變、無蟲蛀的燕麥，除去雜質，潤麥調節水分至25%，平衡12 h。在200～220 ℃炒制20 min，冷卻干燥12 h。粉碎機粉碎過40目標準篩，備用。

傳統工藝：

炒制燕麥米→浸米12 h→蒸煮→接種→30 ℃前酵→16 ℃后酵→壓榨→酒樣

液化工藝：

炒制燕麥米→粉碎→加水混勻→耐高溫α-淀粉酶液化→糖化酶糖化→接種→30 ℃前酵→16 ℃后酵→壓榨→酒樣。

兩種釀造方法的加水量一致，前發酵每隔12 h 測定一次相對失質量（測定前充分攪拌醪液使氣體散出，相對失質量為醪液初始質量減去時間節點時的測定質量），并測定壓榨后酒樣的酒精度、總糖含量與固形物含量。

1.3.3 燕麥黃酒液化與糖化工藝優化試驗設計

液化醪液的DE值控制一般在15%～20%[19-20]。液化DE值低，料液易老化、黏度大、難于操作，也不利于糖化；液化程度過高不利于糖化過程酶與底物形成絡合結構，影響催化效率。

液化時間對液化程度的影響，分別稱取經過預處理的燕麥粉，料水比1∶3.5混勻，依照酶活與燕麥粉質量之比5 U/g的量加入耐高溫α-淀粉酶，混勻后升溫至95 ℃分別液化10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，稀釋后4 500 r/min離心取上清液，測定還原糖含量與固形物含量，計算DE值。耐高溫α-淀粉酶添加量對液化程度的影響試驗，酶活與燕麥粉質量之比分別為3 U/g、4 U/g、5 U/g、6 U/g、8 U/g、10 U/g。液化溫度對液化程度的影響試驗，溫度分別為80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃、100 ℃。

根據單因素試驗所得結果選擇合適的水平范圍，使用L9（34）正交表，以DE值為指標設計3因素3水平的正交試驗確定最優條件組合。

1.3.4 燕麥黃酒糖化工藝優化試驗設計

時間對糖化效果的影響：依照酶活與燕麥粉質量之比80 U/g的量加入糖化酶，混勻，60 ℃分別糖化30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min、210 min、240 min，稀釋后4 500 r/min離心取上清液，測定還原糖含量與固形物含量，計算DE值。糖化酶添加量對糖化效果的影響：酶活與燕麥粉質量之比分別按50 U/g、60 U/g、70 U/g、80 U/g、90 U/g、100 U/g、110 U/g的量加入糖化酶。溫度對糖化效果的影響：溫度分別為40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃。正交試驗設計同液化工藝優化。

1.3.5 燕麥黃酒主發酵工藝優化試驗設計

據相關文獻報道，主發酵時間多集中于3 d[15-17]，本試驗適當延長發酵時間至5 d，以消耗更多的糖分并促進香氣成分的產生。

調整燕麥粉與水的質量之比1∶2.5、1∶3.0、1∶3.5、1∶4.0、1∶4.5，接種酵母量為燕麥粉質量的0.15%，30 ℃分別發酵5 d，醪液4 500 r/min離心取上清液，測定酒精度。酵母接種量對主發酵結果的影響：接種酵母量為燕麥粉質量的0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%。溫度對主發酵結果的影響：發酵溫度為25 ℃、27 ℃、30 ℃、33 ℃、35 ℃。在單因素試驗基礎上，使用L9（34）正交表，以酒精度為指標設計正交試驗確定最優條件組合。

1.3.6 數據處理方法

測定試驗均重復兩次，結果為平均值的方式表示。使用OEA3.1軟件進行正交試驗設計，SAS 9.1進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 傳統方法與液化方法釀造燕麥黃酒對比試驗

圖1 傳統方法與液化方法的發酵曲線Fig.1 Fermentation curves of traditional method and liquefaction method

前發酵過程中醪液的相對失質量測定結果見圖1，醪液的相對失質量能表征發酵的速度與最終原料利用率。由圖1可以看出，液化法起初的發酵速度較慢，這可能是因為前處理過程中淀粉糖化、液化程度較高，使得醪液糖度較高，對發酵母增殖起到抑制作用。但抑制作用解除后，液化發酵速率明顯加快（圖1中段），且高于傳統方法。從終點的相對失質量來看，液化法釀造對原料的利用率要比傳統方法高。同時對兩種方法得到的酒樣測定結果表明，液化法酒樣的酒精度（12.6±0.1）%vol與總固形物（52.8±2.0）g/L含量明顯高于傳統方法（11.1±0.3）%vol，（47.0±0.8）g/L，但液化法酒樣總糖含量（19.6±0.3）g/L卻低于傳統方法（23.7±0.4）g/L，這說明液化法釀造黃酒有更高的原料利用率。

2.2 液化法釀造燕麥黃酒最佳液化工藝條件的確定

2.2.1 液化時間對液化程度的影響

液化時間對液化程度的影響結果見圖2。由圖2可知，液化開始時首先是淀粉酶分解直鏈淀粉產生寡糖，此酶促反應速度較快。而后淀粉酶作用于支鏈淀粉，同時使得部分寡糖水解，但此時酶解產物的積累與1,6-糖苷鍵相對比例的增大會使得酶促反應速度下降[21]。由圖2可以看出，還原糖含量的增加速度比干物質含量增加的速度要快，30 min時DE值達到最大，但是此時的還原糖含量卻沒有達到最大值。而當40 min以后DE值雖稍有降低，但還原糖的含量平穩，干物質量略有升高。因此選擇30～50 min作為較優液化時間。

圖2 液化時間對液化程度的影響Fig.2 Effect of time on liquefaction degree

2.2.2 耐高溫α-淀粉酶添加量對液化程度的影響

耐高溫α-淀粉酶添加量對液化程度的影響結果見圖3。由圖3可知，在酶促反應中，底物濃度足夠高時，酶促反應速度隨著酶添加量的增加而提高[22]。由圖3可知，隨著酶添加量的增大，還原糖與干物質含量均有升高。當液化醪液化程度（DE值）控制在15%～20%時，利于后續液化與發酵。酶添加量＞5 U/g時，DE值上升過快，不利于生產控制。因此選擇3～5 U/g作為較優淀粉酶添加量。

圖3 耐高溫α-淀粉酶酶添加量對液化程度的影響Fig.3 Effect of thermostable α-amylase addition on liquefaction degree

2.2.3 液化溫度對液化程度的影響

液化溫度對液化程度的影響見圖4。由圖4可知，在一定溫度內，酶促反應速度隨溫度的升高而增快，至最適反應溫度后，繼續升高溫度會造成部分酶的失活，使反應速度下降[22]。由圖4可知，在溫度＞95 ℃后還原糖含量有所降低；但干物質含量隨著溫度的升高而增大；在95 ℃時DE值最高，因此得到最適液化溫度為90～100 ℃。

圖4 溫度對液化程度的影響Fig.4 Effect of temperature on liquefaction degree

2.2.4 液化條件正交試驗優化

根據單因素試驗所得結果選擇合適的水平范圍，使用L9（34）正交表，以DE值為指標設計正交試驗確定最優液化條件組合。其試驗設計與結果見表1，方差分析見表2。

表1 液化條件優化正交試驗設計與結果Table 1 Design and results of orthogonal test for liquefaction conditions optimization

由表1與表2可以看出，液化條件對于液化程度的影響均顯著（P＜0.05），主次順序為酶添加量＞溫度＞時間。由正交試驗得到的最佳組合為A2B3C2。即液化溫度95 ℃、液化酶添加量5 U/g、液化時間40 min，在此條件下進行驗證試驗，DE值為21.96%。

表2 液化正交試驗結果方差分析Table 2 Variance analysis of liquefaction orthogonal tests results

2.3 液化法釀造燕麥黃酒最佳糖化工藝條件的確定

2.3.1 糖化時間對糖化程度的影響

糖化時間對糖化效果的影響見圖5。由圖5可知，150 min之前糖化醪的還原糖含量隨時間的推移而升高，在150 min后變化不大，趨于平緩，180 min后基本達到穩定。DE值的變化趨勢與之類似。為保證糖化質量，選取120～180 min作為較優糖化時間。

圖5 糖化時間對糖化效果的影響Fig.5 Effect of time on the saccharification

2.3.2 糖化酶添加量對糖化程度的影響

圖6 糖化酶添加量對糖化效果的影響Fig.6 Effect of glucoamylase addition on the saccharification

糖化酶添加量對糖化程度的影響見圖6。由圖6可知，底物濃度足夠高時，酶促反應速度與酶添加量存在正相關關系。糖化酶添加量為110 U/g時，與糖化酶添加量100 U/g時相比，DE值略有升高但還原糖含量沒有明顯差異，同時兼顧成本因素，確定80～100 U/g為較優糖化酶添加量。

2.3.3 溫度對糖化程度的影響

溫度對糖化程度的影響見圖7。溫度能顯著影響酶促反應，在適宜的溫度范圍內，酶促反應隨著溫度的升高加快，至最適反應溫度時到達最快。若溫度繼續升高，會導致酶失活，使得酶促反應速度降低。由圖7可知，還原糖含量、干物質含量與DE值在溫度≤65 ℃范圍內逐漸升高，但＞65 ℃后糖化酶失活嚴重，三個指標均降低，均因此確定最適反應溫度為60～70 ℃。

圖7 糖化溫度對糖化效果的影響Fig.7 Effect of temperature on saccharification

2.3.4 糖化條件優化正交試驗

表3 糖化條件優化正交試驗設計與結果Table 3 Design and results of orthogonal test for saccharification conditions optimization

根據單因素試驗所得結果選擇合適的水平范圍，使用L9（34）正交表，以DE值為指標設計正交試驗確定最優糖化條件組合。試驗設計與結果見表3，方差分析見表4。

表4 糖化條件正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of saccharification orthogonal tests results

由表3、表4可以看出，糖化條件對糖化程度均有極顯著的影響（P＜0.01），主次順序為溫度＞糖化酶添加量＞時間。由正交試驗直觀分析得到的最佳組合為A2B3C3。即溫度65 ℃，糖化酶添加量100 U/g，時間180 min，此時DE值為77.21%。

2.4 主發酵條件優化正交試驗

圖8 料液比（A）、酵母接種量（B）與發酵溫度（C）對酒精度的影響Fig.8 Effect of material to water ratio(A),yeast inoculum(B) and fermentation temperature(C) on alcohol content

2.4.1 主發酵條件優化單因素試驗

主發酵條件優化單因素試驗結果見圖8。隨著料液比、酵母接種量和溫度的增加，酒精度均呈先上升后下降的趨勢。由圖8可知，料液比對醪液酒精度有明顯影響。加水量較少時，酒精度較低，是因為發酵程度不夠，原料未得到充分利用，酒精轉化效率低。加水量較多時，由于稀釋作用，酒精度也很低，因此確定最佳料液比為1∶3.5；酵母接種量對酒精度的影響極為明顯。酵母接種量較少，原料不能充分發酵；酵母接種量過大則會使得酵母繁殖過快，將部分糖用于自身生長，使酒精度偏低，因此確定最佳酵母接種量為0.25%；當溫度較低時，酵母代謝與繁殖均會很慢。當溫度很高時，酵母代謝與繁殖速率過快，這會導致酵母老化。因此確定最佳主發酵溫度為30 ℃。

2.4.2 主發酵條件優化正交試驗結果

根據單因素試驗所得結果，以酒精度為指標設計正交試驗確定主發酵最優條件組合。試驗設計與結果見表5，方差分析見表6。

表5 主發酵條件優化正交試驗設計與結果Table 5 Design and results of orthogonal test for main fermentation conditions optimization

表6 主發酵條件正交試驗結果方差分析Table 6 Variance analysis of main fermentation orthogonal tests result

由表5、表6可以看出，料液比、酵母接種量與發酵溫度對酒精度均影響顯著（P＜0.05），其中料液比和酵母接種量達到了極顯著水平（P＜0.01），影響大小順序為料液比＞酵母添加量＞溫度。分析得到最佳條件組合為A2B2C2，即料液比1∶3.5、酵母添加量0.25%、發酵溫度30 ℃，在此條件下進行驗證試驗，酒精度為9.2%vol，發酵結束后的殘糖量為10.19 mg/mL。

2.5 最佳工藝條件下燕麥黃酒釀造試驗結果

最佳釀造工藝條件下，再經過16 ℃、30 d的后發酵，壓榨得到的燕麥黃酒呈橙黃色，清亮透明，口味醇和爽口，但有區別于普通稻米黃酒的燕麥發酵特殊香氣。具體品質指標測定結果及國標范圍見表7。由表7可知，在最佳工藝條件下，黃酒酒樣分析結果符合國家標準的各項要求。

表7 最佳工藝條件下燕麥黃酒品質指標Table 7 Basic quality indicators of Chinese oat rice wine under the optimal conditions

3 結論

通過單因素與正交試驗確定了燕麥黃酒的最佳工藝條件，即最佳液化工藝條件為耐高溫α-淀粉酶添加量為5 U/g、液化溫度95 ℃、液化時間40 min；最佳糖化條件為糖化酶添加量100 U/g、糖化溫度65 ℃、糖化時間180 min；最佳主發酵工藝條件為料液比1∶3.5、發酵溫度30 ℃、酵母添加量為0.25%、發酵時間5 d。在此條件下，16 ℃穩定30 d后得到燕麥黃酒。酒樣分析結果符合國家標準的各項要求。本研究及結果可為燕麥黃酒工業化生產提供理論依據。

[1]周素梅，申瑞玲.燕麥的營養及其加工利用[M].北京：化學工業出版社，2009.

[2]XU J G,TIAN C R,HU Q P,et al.Dynamic changes in phenolic compounds and antioxidant activity in oats (Avena nudaL.) during steeping and germination[J].J Agr Food Chem,2009,57(21):10392-10398.

[3]BIEL W,BOBKO K,MACIOROWSKI R.Chemical composition and nutritive value of husked and naked oats grain[J].J Cereal Sci,2009,49(3):413-418.

[4]SINGH R,DE S,BELKHEIR A.Avena sativa(Oat),a potential neutraceutical and therapeutic agent:an overview[J].Criti Rev Food Sci Nutr,2013,53(2):126-144.

[5]TRUSWELL A S.Cereal grains and coronary heart disease[J].Eur J Clin Nutr,2002,56(1):1-14.

[6]TAPPY L,GüGOLZ E,WüRSCH P.Effects of breakfast cereals containing various amounts ofβ-glucan fibers on plasma glucose and insulin responses in NIDDM subjects[J].Diabetes care,1996,19(8):831-834.

[7]XU W,ZHANG Z W,WU B,et al.Genetic diversity in naked oat(Avena nuda)germplasm revealed by AFLP markers[J].Acta Agronomica Sinica,2009,35(12):2205-2212.

[8]BOISNIC S,BRANCHET M C,ERMOSILLA V.Healing effect of a spray containing Rhealba oat colloidal extract in an in vitro reconstitution model of skin[J].Int J Tissue React,2004,27(3):83-89.

[9]胡新中.燕麥食品加工及功能特性研究進展[J].麥類作物學報，2005，25（5）：122-124.

[10]任長忠，胡新中.中國燕麥產業發展報告2010[M].西安：陜西科學技術出版社，2011.

[11]汪建國，沈玉根，黃炎遠，等.燕麥紅曲黃酒的研制[J].中國釀造，2013，32（2）：152-154.

[12]涂 璐，王愛莉，李再貴.燕麥紅曲黃酒多酚含量及抗氧化性研究[J].中國釀造，2012，31（1）：43-45.

[13]謝廣發.黃酒釀造技術[M].北京：中國輕工業出版社，2010.

[14]王 梅，趙光鰲，帥桂蘭，等.液化法釀造黃酒的研究[J].釀酒，2003，29（2）：93-95.

[15]陳佳昕，趙曉娟，吳 均，等.液態法苦蕎酒工藝條件的優化[J].食品科學，2013，34（20）：180-192.

[16]郭克娜，姜璐璐，闞建全.薏米酒發酵前淀粉液化及糖化條件的優化[J].食品科學，2013，34（5）：197-201.

[17]楊雅利，闞建全，沈海亮，等.紫甘薯酒發酵工藝條件的優化[J].食品科學，2012，33（3）：157-162.

[18]韓德權，章佳佳.DNS 法在普魯蘭多糖發酵液中糖測定的研究[J].食品工業科技，2008（2）：285-286.

[19]吳秀媛.啤酒釀造過程所用輔料大米糊化，液化工藝研究[J].啤酒科技，2006（4）：55-56.

[20]顏懷偉.大米直接磨漿酶液化酸糖化主發酵提取酒精生產燃料酒精方法：中國，CN1958804 B[P].2010-06-23.

[21]張國權，史一一，魏益民，等.蕎麥淀粉耐高溫α-淀粉酶液化工藝條件研究[J].中國糧油學報，2009，23（3）：73-77.

[22]郭 勇.酶工程[M].北京：科學出版社，2009.