東北酸菜品質評定及發酵優良菌株篩選

趙國忠，王夢穎，韓俊燕，趙建新，張 灝，陳 衛*

（江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122）

東北酸菜因其鮮咸酸爽、脆嫩可口、開胃解膩，并能幫助消化等優點，成為盛行于東北的一種腌制菜品[1]。酸菜營養豐富，含有纖維素、礦物質及人體代謝不可缺少的有機化合物，如乳酸、膽堿、乙酰膽堿、維生素C、維生素B12等，其不僅風味獨特，而且具有調節血液平衡、調節膽固醇、預防動脈粥樣硬化等生理功效[2]。東北地區冬季氣候寒冷，腌制貯存大白菜可延長其保藏期，在酸菜腌制過程中，發酵液中的微生物起了關鍵的作用，它們可發酵碳水化合物產酸，促進酸菜獨特風味及其特殊生理功能的形成。

近年來，岳喜慶等[3-4]對東北酸菜的質地變化、感官品質、各種理化指標及風味變化研究較為突出，并且確定了自然發酵酸菜的5種主體風味成分：二甲基二硫、二甲基三硫、（E，Z）-2,6-壬二烯醛、乙醛和2-戊基呋喃。SUZZI G等[5]對酸菜中的有害物質如生物胺有深入的研究。但還未發現有關于東北酸菜菌株微生態與感官質量、理化特性之間的聯系的相關研究，二者之間的相關聯系尚不明確。本實驗對不同緯度東北三省多個地區的酸菜進行樣品采集、感官評定，探討其感官品質與其理化指標之間的關系，尋找其中的相互聯系，并分析其原因。此外對感官得分高的酸菜樣品中的優良菌株進行分離篩選，以期從天然發酵酸菜產品中尋找優質菌種資源，為實現優良菌株微生態的有效利用奠定良好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

東北酸菜：從東北三省的普通家庭腌制酸菜中隨機采集24份成熟酸菜樣品，樣品具體來源及對應編號見表1。

表1 24份東北酸菜樣品的來源與編號Table 1 24 parts of the sources and numbers of Northeast sauerkraut samples

分析所用試劑均為市售分析純；有機酸檢測所用試劑為市售色譜純；乳酸細菌培養基（MRS）參考文獻[6-7]配制。

1.2 儀器與設備

FE-20精密pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；DK-S12恒溫水浴鍋：上海森信實驗儀器有限公司；UV1800紫外可見分光光度計：日本島津公司；1525型高效液相色譜儀：美國沃特斯公司；ZHJH-C1115B超凈工作臺：上海智誠分析儀器制造有限公司；MLS-3750立式壓力蒸汽滅菌鍋：日本SANYO公司；SP-250生化培養箱：南京實驗儀器廠；DM 2000熒光顯微鏡：徠卡儀器（德國）有限公司；T100 Thermal Cycler PCR儀：美國伯樂BIO-RAD公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酸菜樣品感官評定方法

取出一定量酸菜樣品放置于潔凈瓷盤中，組織一個由20位專業感官評定人員組成的感官評定小組，分別從色澤、氣味、滋味、質地等4個方面對酸菜樣品進行評價，評定采用打分制，評分標準見表2，共13個評價項目，總分為130分。

1.3.2 理化指標檢測方法

酸菜樣品中各種理化指標的測定方法如下：總酸的測定方法參考國標GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》；還原糖的測定方法參考國標GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測定》；亞硝酸鹽的測定采用鹽酸萘乙二胺法，參考國標GB/T 5009.33—2010《食品安全國家標準食品中硝酸鹽與亞硝酸鹽的測定》；有機酸測定方法參考國標GB/T 5009.157—2003《食品中有機酸的測定》。

酸菜樣品中氨基酸種類及含量的測定送至江南大學檢測中心進行。

表2 酸菜感官評定標準Table 2 Sensory evaluation standard of sauerkraut

1.3.3 菌株篩選及鑒定

菌株篩選方法[8]：將不同酸菜樣品汁液分別用生理鹽水進行梯度稀釋，選擇10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6這6個稀釋度的菌液在MRS平板上進行涂布，然后在37 ℃的恒溫培養箱中培養24～36 h，觀察長出的單菌落，挑取不同形態、大小的菌落進行劃線純化，三次分離純化之后，對菌株進行革蘭氏染色鏡檢，并確定菌株形態，將鏡檢后的菌株接種于MRS液體管中進行傳代培養，然后于MRS斜面培養基中劃線培養，最后于4 ℃冰箱保存，備用。

菌株鑒定方法：采用16S rDNA序列分析法對篩選到乳酸菌進行序列分析，確定其種屬。將活化好的菌液，參考文獻[9]中的基因組提取方法，對菌株的全基因組DNA進行提取，對得到的基因組DNA的16S rDNA區域進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，選擇細菌通用引物進行擴增，上游引物27F序列：5′-AGAGTTTGATCCTGGCCTCA-3′，下游引物1492R序列：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，擴增片段分別為1 500 bp。PCR體系50 μL：10×buffer 5 μL；三磷酸脫氧核糖核苷（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）5μL；上游引物（25μmol/L）0.5 μL；下游引物（25 μmol/L）0.5 μL；TaqDNA聚合酶（250 U）0.5 μL；模板DNA 1.5 μL；ddH2O 37 μL。PCR擴增條件為：95 ℃、3 min；95 ℃、10 s；55 ℃、30 s；72 ℃、1 min；72 ℃、5 min，2～4步進行30個循環。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度及濃度，將達到測序要求的擴增產物送至上海桑尼生物科技有限公司進行測序，將測序結果在美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）上用Blast進行比對，并確定其種屬。

2 結果與分析

2.1 東北不同地區酸菜的感官評定

對采自東北三省不同地區的24個酸菜樣品進行感官分析，評價采用打分制，分數越高則樣品感官質量越好、接受度越高，對每個酸菜樣品的得分結果進行分析，統計計算平均總得分，其中總分為130分，感官評價得分見表3。

表3 樣品感官得分Table 3 Sensory scores of samples

由表3可知，感官得分最高的3個樣品分別為來自遼寧省的L-6、L-5及吉林省的G-5，這三個樣品無論從色澤、滋味、質地上都優于其他樣品，感官評定得分最低的樣品分別為來自黑龍江延壽的H-2、吉林省G-11及黑龍江省的H-4，相對其他樣品而言，它們的綜合感官質量比較低。

整體分析感官數據可以發現，遼寧省的樣品中75%樣品的感官得分高于平均分，其比例在3個省份中最高，而黑龍江省的酸菜樣品的感官得分總體較低，吉林省樣品居中，說明樣品的感官質量在省份之間差異較大，整體而言，遼寧省酸菜樣品感官質量最高。

2.2 總酸含量結果分析

酸菜在發酵過程中，微生物經過三羧酸循環和無氧呼吸會發酵產生乳酸、乙酸等各種有機酸，酸的產生不僅可以改善酸菜的風味，而且能有效抑制腐敗菌的生長[10-11]，現采用酸堿滴定法對酸菜樣品中的總酸含量進行測定，測定結果見圖1。

由圖1可知，不同地區的酸菜樣品總酸含量差異較大，其中感官評定得分最高的L-6具有較高的酸度，達到0.18 mol/L。整體分析，遼寧省所有樣品的總酸含量均高于平均值，而吉林省酸菜樣品總酸含量高于樣品平均值的比例僅為36.36%，這與各省的整體感官質量變化趨勢相符合。同時，觀察數據可以發現，感官質量比較低的樣品H-2、H-4、G-11的總酸值均低于平均值。由上述分析可知，樣品總酸含量與感官質量之間具有相同的變化趨勢，總酸含量高的產品感官得分較高。分析出現該現象的原因可能是因為遼寧省所處緯度較其他三省要低，冬季溫度略高于其他省，在酸菜發酵過程中有益微生物的量最多，從而發酵產生更多的酸。

圖1 不同東北酸菜樣品中總酸含量Fig.1 Total acid content in different Northeast sauerkrauts

2.3 還原糖含量結果分析

對酸菜樣品中的還原糖含量進行測定，測定結果見圖2。

圖2 不同東北酸菜樣品中還原糖的含量Fig.2 Reducing sugar content in different Northeast sauerkrauts

由圖2可知，吉林省樣品G-4的還原糖含量最高，其次是G-5，還原糖含量最低的樣品為G-2，吉林省樣品中還原糖含量高于平均值的樣品比例達到72.72%，分析比較數據，發現還原糖的含量與感官品質沒有明顯的聯系。

2.4 氨基酸結果分析

氨基酸是酸菜樣品中主要的香味、風味來源，發酵蔬菜中含有的氨基酸的鮮味遠超過單純的谷氨酸鈉的鮮味[12]。分別對感官得分較高和較低的2組樣品進行氨基酸種類和含量的測定，其氨基酸總量測定結果見圖3，L-6樣品中具體氨基酸種類和含量見表4。

圖3 四組酸菜樣品中氨基酸的含量Fig.3 Amino acid content in four kinds of Northeast sauerkrauts

由圖3可知，樣品之間氨基酸含量存在較大差異，其中感官得分最高的樣品L-6的氨基酸含量最高，達到2 212 mg/L，其次是G-11、H-2，分別達到1 398 mg/L和1 179 mg/L，氨基酸含量最低的樣品為L-5，含量為842 mg/L。由此得出，感官得分高的酸菜樣品氨基酸含量較高，微生物可能在氨基酸代謝過程中發揮了重要的作用。

表4 L-6樣品中氨基酸種類和含量Table 4 Types and contents of amino acids in L-6 sample

由表4可知，L-6樣品中含有17種游離氨基酸，其中丙氨酸含量最高，達到629.46 mg/L，占總氨基酸量的28.46%，半胱氨酸含量最低，為1.05 mg/L，僅占樣品氨基酸總量的0.05%，此外，樣品中含有除了色氨酸以外的其他7種人體必需氨基酸，總量達到422.89mg/L，占總氨基酸含量的30.25%，杜書等[13]對自然發酵酸菜中游離氨基酸進行測定，同樣也發現其中含有7種人體必需氨基酸。以上數據表明，酸菜具有較高的營養價值。

2.5 亞硝酸鹽結果分析

傳統酸菜采用鹽漬、發酵法進行生產，蔬菜中的硝酸鹽易被發酵過程中的微生物轉化為亞硝酸鹽，而它是一種致癌物前體，長期大量食用會對身體健康造成威脅[14-15]。采用鹽酸萘乙二胺法[16]對24個酸菜樣品中亞硝酸鹽含量進行檢測，測定結果見圖4。

圖4 不同東北酸菜樣品中亞硝酸鹽含量Fig.4 Nitrite content in different Northeast sauerkrauts

由圖4可知，感官得分、酸度較高的酸菜樣品L-5、L-6的亞硝酸鹽含量很低，幾乎為零，而感官得分、酸度較低的樣品H-4，亞硝酸鹽含量較高，達到7.5 mg/kg。同時還發現，黑龍江省的所有酸菜樣品的亞硝酸鹽含量均高于24組樣品平均值，而其感官得分在三個省中也最低，酸度也偏低。由此可推測在感官質量、酸度和亞硝酸鹽含量三者之間存在重要的相互關系，即酸菜樣品的感官質量與酸度呈正比，與亞硝酸鹽含量呈反比。推測感官得分較高的酸菜發酵過程中有益菌含量高，產酸量大，進而腐敗菌生長較少，亞硝酸鹽含量低。

2.6 發酵微生物菌株的分離鑒定

酸菜發酵過程中微生物群系起了重要的作用，其中乳酸菌占主導地位[17-19]，對感官得分較高的酸菜樣品中的乳酸菌進行篩選。實驗分離得到8株乳酸菌，對其16S rDNA片段擴增并進行測序，在NCBI上進行Blast比對分析對應的序列，比對結果見表5。

表5 菌株序列比對結果Table 5 Sequence results of strains

由表5可知，在篩選出的8株細菌中有6株植物乳桿菌、1株鼠李糖乳桿菌和1株布氏乳桿菌，這三種乳桿菌均能夠發酵白菜中的糖分產生乳酸等有機酸，其中，植物乳桿菌為主導發酵菌株，在發酵體系中豐度較大，能夠快速產生乳酸及其他風味物質。

3 結論

實驗結果顯示，不同緯度的酸菜樣品感官質量差異較大，緯度較高省市的酸菜感官質量低于緯度低地區。緯度越高的地區冬季氣溫越低，在過低的溫度時，微生物活性較低、生長緩慢，導致發酵體系中有益發酵菌株含量較低，不利于有機酸及其他風味物質的形成，也更易產生各種腐敗菌，導致亞硝酸鹽含量增加。酸菜樣品的感官質量與其酸度、氨基酸、亞硝酸鹽含量等理化特性有密切的聯系，感官質量越高的樣品其酸度、氨基酸含量相對越高，亞硝酸鹽的含量相對越低，其在發酵過程中可能有較大的乳酸菌豐度，如植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和布氏乳桿菌均能發酵產酸、醛、酯類物質，經過其發酵的蔬菜，不僅碳水化合物和蛋白質類物質得到進一步分解，利于人體消化吸收，而且其酸類物質及其相關代謝產物進而會抑制生產亞硝酸鹽的腐敗菌的生長。

從酸菜樣品中成功篩選出能發酵產生有機酸及其他風味物質的植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、布氏乳桿菌，對酸菜發酵過程中存在的微生物菌系有了一定的了解，有助于后期優質高產酸菜發酵菌種的篩選，為中國發酵酸菜的工業化奠定良好的基礎。

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