植物-微生物聯合修復石油污染土壤的實驗室模擬研究

雒曉芳，樊國慶，王 瑾，王鴻雁，田丹妮，汪如婷

（1.西北民族大學 實驗中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030）

隨著我國石油工業的不斷發展，石油污染土壤對生態環境造成了嚴重污染，它對土壤的影響是破壞土壤結構，影響土壤的通透性，而且還會損害植物根部，阻礙有氧呼吸的進行和對營養物質的吸收，最終將導致植物的死亡。再者，石油里的一些有毒物質若直接進入人的食物鏈中，勢必會對人體的健康構成巨大威脅。所以，鑒于以上原因，石油污染土壤問題已經引起了全世界各國科學家的廣泛關注。我國石油污染相當嚴重，石油污染土壤生物處理技術發展較晚。劉期松等[1]于1978年率先開展了石油污染區微生物生態及降解石油的研究，分離出126株細菌，60%菌株有解脂酶活性，真菌有71株，89%有解脂酶活性。對原油降解率分別為19%～33%和17%～45%，為石油污染生物處理奠定了基礎。

目前，植物-微生物聯合修復已成為石油污染土壤修復研究領域的熱點，該技術可以將植物修復與微生物修復兩種方法的優點相結合，從而強化根際有機污染物的降解。利用植物-微生物聯合作用降解石油污染土壤，這是因為根際中植物-微生物的相互作用往往是互惠的。植物根表皮細胞的脫落、植物滲出物等為根際微生物提供了營養源、植物根系巨大的表面積也是微生物的寄宿之處[2]，微生物的活動也會促進植物生長和根系分泌物釋放。

植物可以促進根際微生物的降解轉化作用，已經被很多研究所證實。植物為微生物提供了生存場所，并可轉移氧氣使根際的有氧呼吸作用能夠正常進行；植物的根向根際釋放碳水化合物、氨基酸和有機酸等，這些物質刺激了根際各種菌群的生長繁殖[3-4]，增強了細菌的聯合降解作用；根際土壤微生物數量一般是無根系土壤的5～20倍，有的高達100倍[5]。根際形成的有機碳可以阻止有機化合物向地下水轉移，也可以增加微生物對石油污染物的礦化作用；某些情況下植物根分泌物也可作為天然的共代謝底物促進污染物的降解。此外，植物根系可以伸展到不同層次的土壤中，因此無需混合土壤就可使降解菌分散在土壤中[6]。另一方面，根際微生物的活動也會促進根系分泌物的釋放，并可保護植物免受化學物質的傷害。

本研究通過盆栽實驗，研究了土壤中不同質量分數石油對土壤中微生物數量的影響，以及對土壤殘油量進行了測定；以便為以后的石油污染土壤的治理和控制提供理論基礎和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以陜西姬塬油田附近被石油污染的土壤為樣本，以石油為唯一碳源，通過富集培養和特殊培養基分離法，最終分離篩選出具有高效石油降解能力的八株菌，這八株菌暫時命名為S1、S2、X1和X2、Q1、Q2、J1、J2，將八株菌按照均量配比制備為混合菌劑，待用。

1.2 儀器與設備

QH2-98A全溫度振蕩培養箱：江蘇太倉華美生化儀器廠；HVE-50高壓濕熱滅菌鍋：日本Hirayama公司；DHP-9162電熱恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；ES-300E電子天平：長沙湘平科技發展有限公司；BCD-235型冰箱：青島海爾股份有限公司；DK-S24電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；XW-80A漩渦混合器：江蘇海門市麒麟醫用儀器廠。

1.3 實驗設計

利用盆栽實驗，共設置15個樣品，其中6個為對照（CK）。將取自陜西姬塬油田的石油分別配制成為2.0%、4.0%、8.0%三個質量分數梯度，將上述菌劑配制成0.5%、1.5%、3.0%。實驗組合方式見表1。

表1 實驗組合方式Table 1 Combination ways of the experiment

1.3.1 土壤處理與播種

首先，將取得的土壤粉粹，并將其過40目篩，每個花盆2 kg土壤。將原油分別配制成質量分數為2.0%、4.0%、8.0%，菌劑質量分數為0.5%、1.5%、3.0%。每盆播種10粒種子，待發芽1 d后接種微生物。

1.3.2 土壤采樣

本實驗采用五點取樣法對花盆中的土樣進行取樣，土樣分別取自0 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d和56 d的土壤。然后倒入250 mL滅菌三角燒瓶中，混勻，讓其自然風干。

1.3.3 微生物數量的測定

A：培養基的配制

（A1）酵母培養基采用麥氏培養液：葡萄糖1.0 g，氯化鉀1.8 g，酵母浸膏2.5 g，醋酸鈉8.2 g，蒸餾水1 000 mL。

（A2）細菌培養基采用營養肉湯培養基：蛋白胨5.0 g，牛肉浸取物3.0 g，氯化鈉5.0 g，蒸餾水1 000 mL。

B：微生物數計數

將采取的1 g土壤于10 mL無菌水中，稀釋成10-4、10-5、10-6三個梯度，分別取這三個梯度的菌懸液0.1 mL接種于相應培養基中，于37 ℃培養箱中培養48 h后觀察記錄菌落數量。酵母菌培養溫度為28 ℃，培養時間為3～5 d；細菌培養溫度為35 ℃，培養時間為1～2 d。

根據不同培養基中生長出的菌落數統計細菌和酵母菌數量，結合土壤樣品的稀釋倍數，按照公式：土壤微生物濃度（CFU/g）=（菌落平均數×稀釋倍數）/每皿菌液加入量（mL），求得土壤中真菌、細菌和放線菌濃度[7]。

1.3.4 石油殘留量的測定

A：土壤預處理

采用五點采樣法采取土壤樣品，待其自然風干、磨碎、過100目篩，稱取10 g土壤于折疊好的濾紙筒中，將旋轉蒸發瓶洗凈，烘干，稱質量記為G1。

B：殘油的提取

①將濾紙筒放入索氏提取器中，加入150 mL左右的正己烷于70 ℃水浴鍋上回流6 h，待提取液無色，即回流完畢，將收集到濾液于旋轉蒸發儀上蒸干正己烷。

②將旋轉蒸發瓶于95 ℃烘箱中烘干，然后置于干燥器中冷卻30 min后稱質量，記為G2。

③G2-G1即為提取物（石油），計算出土壤中石油含量，從而可以用下式計算出石油降解率。

式中：R表示石油降解率，%；G0表示原始含油量，g；G1表示燒瓶凈質量，g；G2表示提取物質量，g；（G2-G1）表示提取的石油質量，g。

2 結果與分析

從圖1可以看出，在0～7 d內微生物的數量增長的較慢，主要是由于微生物剛剛接種到含石油的土壤中，微生物對這種特殊環境有一個適應階段。所以微生物在此階段基本上不表現出菌體數量的增加。此階段微生物數量最大為（3.0%菌劑+8.0%石油）組，最大值為20.0×106個/g土壤。

圖1 不同石油濃度和菌劑濃度在不同培養時間下的微生物數量(×106個每克土壤)Fig.1 Number of microorganisms at different petroleum density,microorganism addition and culture time

在7～14 d內微生物的數量幾乎呈指數式增長，此階段微生物對周圍的石油環境已經適應，開始利用有機物進行生長代謝。此時微生物的生長很平衡，即細胞內各種成分按比例有規律的增加，對石油污染物的降解速率也是最快的。在14～28 d內微生物數量繼續增加，但增長速率不是太快。最明顯的變化是（3.0%菌劑+4.0%石油）組的生長速率超過了（3.0%菌劑+8.0%石油）組，由此可知，8.0%質量分數的石油對微生物產生了毒性。再者，此階段由于營養物質（石油污染物）開始缺乏，使微生物生長速率較前一階段小。當微生物生長到28 d時，微生物數量達到最大值：95.8×106個/g土壤；對應的石油降解率為74.5%。此時細菌的數量為111.0×106個/g土壤；酵母菌數量為80.5×104個/g土壤。在28～56 d這段時間，由于微生物次級代謝產物的積累、營養物質消耗殆盡、土壤板結、pH值變化等因素，導致微生物的生理代謝需求得不到滿足，甚至直接造成微生物的死亡（有些微生物產生的抗生素也會殺死一些微生物）。所以此階段微生物數量開始下降，最低降至2.8×106個/g土壤。

在對照組（圖2）中，微生物數量最多的為只加3.0%菌劑的組，最大值達到14.5×106個/g土壤。該組沒有加石油，但是它的微生物數量的基數（3.0%菌劑）是最大的，所以它的微生物數量大于其他組。而在實驗組中，（3.0%菌劑+4.0%石油）組微生物數量為95.8×106個/g土壤。對比二者可以發現，在同樣的菌劑濃度（3.0%）下，限制微生物增長的主要因素為營養物質（石油）的質量分數。

另外，只加入石油的組微生物數量也出現了波動，4.0%石油質量分數的組同樣在28 d達到最大值11.5×106個/g土壤；而且可以看出8.0%石油質量分數的組微生物數量的最大值為9.5×106個/g土壤。8.0%石油質量分數組的微生物數量＜4.0%石油質量分數的組，進一步說明了8.0%質量分數的石油確實會對微生物產生毒害作用，而且有可能一些微生物在剛剛加入石油污染物的時候就已經被毒死，該組（8.0%石油）的微生物數量降至所有對照組最小值：4.5×106個/g土壤。還應該指出的是，只加石油的組微生物是土壤中的一些土著微生物種群。

圖2 不同石油濃度和培養時間下的對照組微生物數量(×106個每克土壤)Fig.2 Number of microorganisms of the control group at different petroleum density,microorganism addition and culture time

從圖3可知，微生物對石油的降解曲線類似于圖1中微生物的數量增長曲線，表現出一定的規律性，總的趨勢是從低到高，再從高到低。第7天時測得微生物對石油的降解率最低組（0.5%菌劑+2.0%石油）為11.4%；最高組（3.0%菌劑+4.0%石油）為28.9%。造成此階段石油降解率偏低的主要原因是微生物的數量還不夠多，此階段的微生物正處于適應期，并且這里測定的石油降解率主要是石油自身揮發造成的，因為很少微生物在這個階段能夠利用石油進行代謝反應。

圖3 在不同石油濃度、菌劑濃度以及不同培養時間下的石油降解率Fig.3 Effects of different petroleum density,microorganism addition and culture time on petroleum degradation

隨著微生物數量的增加，在14～28 d內石油降解率穩步上升。同樣，在微生物數量最多的時候（28 d）達到最大石油降解率74.5%；此時石油降解率較高的還有72.4%和71.8%，它們對應的微生物數量分別為95.8×106個/g土壤、76.0×106個/g土壤、68.8×106個/g土壤；在相同的石油質量分數（4.0%）下，微生物對石油的降解率受菌劑濃度的直接影響，如在28 d時，（3.0%菌劑+4.0%石油）組的石油降解率為74.5%，而（1.5%菌劑+4.0%石油）組下的石油降解率僅為47.1%，所以在一定的程度上，菌劑濃度越高，對石油的降解率就越大。

但是，白云等[8]通過實驗發現，降解60 d后，接種量為0、5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL、30 mL石油烴降解率分別為22%、46%、54%、60%、64%、74%、70%。通過以上數據可以看出，并非投加量越大，對去除促進就越大，即高效菌的投加量與降解率之間存在一個適宜的投加值。

土壤中廣泛分布著可降解石油的微生物菌種，它們是土壤生物修復作用的主角。因為石油系天然有機物，故而微生物發展了利用石油的能力是不足為奇的。但是數量上相差很大，一般為細菌總數的0.13%～0.50%[9-10]。土壤中降解石油微生物的數量與污染物的存在有著密切的關系。它們能夠適應環境，然后進行選擇性富集并發生遺傳改變，從而導致烴類降解菌所占比例及編碼降解烴類基因的質粒數量增加[11]。

圖4 在不同石油濃度、菌劑濃度以及不同培養時間下對照組的石油降解率Fig.4 Effects of different petroleum density,microorganism addition and culture time on petroleum degradation of the control group

從圖4可知，對照組處理（2.0%、4.0%、8.0%石油質量分數）中雖然沒有加入菌劑，但是加入的石油污染物使土壤狀況得到改善，刺激了土著微生物的生長，所以對石油具有一定的降解率。4.0%的石油比8.0%的石油降解的更快，在56 d時分別為21.2%、14.9%；出現此結果的原因可能是8.0%的石油黏度比較大，從而揮發性＞4.0%的石油，二者石油降解率的差異實質上是石油揮發度不同造成的；此時微生物（實為土著微生物）的數量分別為6.5×106個/g土壤和4.5×106個/g土壤，這兩個數據相差不大，在無外源微生物菌劑加入時，可以認為土著微生物對石油的降解作用很小。

對于土著微生物對石油降解率的影響，倪娜[12]認為，土著微生物長期在污染的環境中生長，自身具備對石油烴較好的適應能力和較高的降解能力，因此從石油污染的土壤中分離出具有石油降解能力的土著微生物，將其富集后重新投入到石油污染土壤中進行生物強化實驗理論上效果應該更優。UENO A等[13]從做過生物刺激實驗的土壤中分離出有高效降解能力的菌株J，將其富集后重新投放回原污染土壤中進行生物強化實驗，最終總石油烴（total petroleum hydrocarbon，TPH）降解率為50%左右，比同等條件下用外源菌株WatG的強化處理效率高。ATAGANAH I等[14]采用從雜芬油污染土壤中分離出的5種真菌進行本土生物強化實驗，結果發現在生物強化處理中，4環和5環多環芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbon，PAHs）在70 d的實驗后降解率可達90%，比其他用細菌等進行的生物強化效率高出很多。這些結果均說明在應用土著微生物進行生物強化實驗時比用外源微生物強化時有較明顯的優勢。

3 討論

當石油質量分數相同時，隨著菌劑濃度的提高，微生物數量有明顯的增加。本實驗以石油為唯一碳源，所以在一段時間內，微生物的數量在某種程度上取決于微生物加入時的基數；當菌劑濃度相同時，石油質量分數高的樣品微生物增加更快。所以，在微生物的耐受范圍內，碳源物質的增加有利于微生物繁殖。當菌劑濃度和石油質量分數進一步提高時，微生物數量增加得快，但也減小得快。從代謝的角度考慮，是因為微生物體內積累了不少的次級代謝產物，諸如抗生素等物質。這些物質對大多數微生物都有毒害作用，有的甚至直接殺死微生物，導致微生物的數量下降，從而也導致了石油降解率的下降。

當有足夠可利用的石油污染物時，在一定時間內微生物不斷繁殖，可以使石油降解率達到最大，這是生物修復過程中最希望出現的最佳狀況[15]。但是這種情況出現的條件是石油污染物濃度不是太大，否則會對微生物直接產生毒害作用。在對照組實驗中，僅僅加石油或菌劑對微生物數量無太大影響。因為只加入菌劑的樣品無營養物質（本實驗為石油污染物）的供應，所以導致微生物幾乎無法生長，從而沒有微生物數量大量的積累；而只加入石油（營養物質）卻沒有微生物的消耗利用，也不會有微生物數量的積累，積累的僅僅是一些數量不多的土著微生物。由于土壤微生物在降解過程中產生的酸性物質在土壤中一般有累積效應，則會導致pH進一步降低，所以在偏酸性石油污染土壤的生物修復中，為了提高微生物的代謝活性和降解石油的速率，可以在土壤中加入一些酸堿緩沖液調整土壤的pH[16]。

4 結論

當石油污染物的最適質量分數范圍介于4.0%～8.0%之間，菌劑濃度在3.0%時，植物-微生物聯合降解石油污染物有較好的效果，微生物數量介于68.8×106～95.8×106個/g土壤；石油降解率介于72.4%～75.4%。如果石油質量分數＞8.0%會對微生物產生毒害作用，有的甚至直接殺死微生物。多數情況下，需要對石油污染物進行稀釋處理，然后再加入菌劑，這樣可以避免因石油濃度過高而殺死微生物，造成微生物菌劑的浪費。

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