不同分級的慢性萎縮性胃炎患者Runx3基因甲基化狀態及蛋白表達的研究

王 倍 趙春娜 張麗麗 郭 楓 肖麗麗 張春華

（黑龍江省大慶市大慶油田總醫院，黑龍江 大慶 163411）

不同分級的慢性萎縮性胃炎患者Runx3基因甲基化狀態及蛋白表達的研究

王 倍 趙春娜 張麗麗 郭 楓 肖麗麗 張春華

（黑龍江省大慶市大慶油田總醫院，黑龍江 大慶 163411）

目的探討不同分期慢性萎縮性胃炎（CAG）患者Runx3基因啟動子甲基化狀態，并分析與Runx3蛋白表達的相關性。方法搜集150例疑似CAG患者進行胃鏡檢查，取少許胃黏膜進行病理檢查，依據病理結果將人群分為胃黏膜正常組、胃黏膜輕度、中度及重度改變4組人群，采用Sequenom公司的基質支持的激光釋放/電離飛行時間質譜分析方法（MALDI-TOF MS）測定Runx3啟動子甲基化狀態；ELISA方法測定Runx3蛋白的表達。結果經病理檢查胃黏膜正常組30例，胃黏膜輕度改變62例，中度改變23例，重度改變35例，CAG患者的Runx3基因啟動子甲基化明顯高于正常組（P＜0.05）；且在不同分級中的甲基化狀態也不同（P＜0.05）；Runx3基因啟動子甲基化與蛋白表達呈明顯的負相關（P＜0.05）。結論Runx3基因甲基化狀態與CAG的分期嚴重程度呈正相關，且會造成其蛋白表達量的降低。

慢性萎縮性胃炎；Runx3基因甲基化狀態；蛋白表達

慢性萎縮性胃炎（CAG）是一種胃黏膜發生萎縮性改變的慢性胃炎，具體的發病機制尚不是非常的清楚，但隨著幽門螺旋桿菌感染率的增高，環境污染物加重及不健康的生活方式如高脂、高鹽飲食、蔬菜水果攝入不足等問題的凸顯，使得我國CAG的患病率呈上升趨勢，成為困擾數百萬人的常見胃部疾病[1-3]。長期的CAG改變可導致機體胃癌發病率的增高，1978年世界衛生組織已將CAG列為胃癌的癌前狀態，可見尋找早期CAG癌前病變對降低其胃癌的發病率有很大的幫助，從而達到早期預防及治療的作用，是對臨床工作的推動。

1 對象與方法

1.1 研究對象

大慶油田總醫院消化科2013年6月至2013年10月150例疑似CAG患者，所有選取的研究對象均經過嚴格的納入和排除標準進行篩選，納入標準：所有患者均具有CAG相應的臨床表現。排除標準為：近期有細菌或病毒感染，有心、肝、腎及血液系統相關疾病，經期或孕期婦女。所有研究對象均簽署相應知情同意書。

1.2 生物樣品的收集

對所有滿足納入和排除標準的150例研究對象進行胃鏡檢查并取相應組織做病理檢查，結合病理分型，將150例研究對象分為胃黏膜正常組、胃黏膜輕度、中度及重度改變四組人群。采集所有研究對象外周靜脈血2 mL，分裝于兩支EDTA抗凝管中，一份立即離心收集其血清用于Runx3蛋白含量的測定，另一份用于提取DNA，測定Runx3基因啟動子甲基化的狀況，在整個分析過程中采用嚴格的質量控制，所有生物樣品均儲存與-80 ℃低溫冰箱中。

1.3 Runx3基因啟動子甲基化測定

用天根DNA提取試劑盒提取外周靜脈血中的DNA，經過定量、純度檢測后，采用sequenom公司的基因分析系統，用基質支持的激光釋放/電離飛行時間質譜分析方法測定基因啟動子的甲基化定量分析。先用亞硫酸氫鈉進行修飾，由zymo公司提供，其他后續過程所需試劑和芯片均來自sequenom公司，CPG島序列參照UCSC數據庫，引物由sequenom相應設計軟件Epidesigner設計，上海生物工程公司合成，結合相應的參考文獻，正向序列為aggaagagag TTACGAGGGGCGGTCGTACGC，反向序列為cagtaatacgactcactataggg agaaggctAAAACGACCGACGCGAACGCCTCC。

1.4 Runx3蛋白表達情況

選用ELISA試劑盒測定Runx3蛋白含量，具體的實驗步驟參照說明書進行，試劑盒購買于Abcom公司。

1.5 統計學處理

選用SPSS16.0進行數據的統計分析。定量數據用（xˉ±s）表示，定性資料選擇構成比表示，獨立樣本t檢驗、方差分析等研究調查對象之間年齡的差別，甲基化狀態及蛋白表達量的差別，采用χ2檢驗分析兩組研究對象吸煙、飲酒的差異，假設檢驗水準定為α=0.05。

2 結 果

2.1 研究對象的基本概況

根據病理學結果，將將150例研究對象分為胃黏膜正常組、胃黏膜輕度、中度及重度改變四組人群。對這4組人群的基本情況進行分析，包括年齡、吸煙及飲酒方面，結果無統計學差異，均衡可比。

2.2 4組人群中Runx3基因啟動子CpG島甲基化狀態的分析

正常組甲基化率為（6.7±2.4）%，輕度改變組甲基化率為（10.0 ±8.8）%，中度改變組甲基化率為（18.3±9.3）%，重度改變組甲基化率（23.4±12.1）%。Runx3啟動子CpG島甲基化陽性表達率在CAG患者明顯高于胃黏膜正常組（P＜0.05），且重度及中度胃黏膜改變組甲基化率明顯高于正常組和輕度改變組（P＜0.05），但胃黏膜輕度改變組與正常組之間，中度改變組與重度改變組之間無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 4組人群中Runx3蛋白的表達

Runx3蛋白的濃度在CAG患者明顯低于胃黏膜正常組（P＜0.05），且重度及中度胃黏膜改變組甲基化率明顯低于正常組和輕度改變組（P＜0.05），但胃黏膜輕度改變組與正常組之間，中度改變組與重度改變組之間無顯著性差異（P＞0.05），見表1。

表1 4組人群的Runx3蛋白表達的比較分析

3 討 論

Runx3基因是Runx家族主要成員之一，是一種常見的抑癌基因。位于人的1號染色體上，該基因的轉錄受兩種結構的啟動子控制，內含大量的CPG島的保守序列，這種CPG島的甲基化的改變可導致轉錄過程受阻，可影響Runx3蛋白的分泌，而Runx3蛋白是TGF-β信號轉導通路中的一個轉錄因子，參與細胞生長的負調控。Runx3蛋白缺失會導致TGF-β1引導的信號通路阻斷，細胞對TGF-β1誘導的生長抑制作用和凋亡反應能力下降，最終影響到胃腸道上皮細胞的正常生長。目前國內外研究均已發現在多種消化道腫瘤特別是胃癌中均可能存在Runx3基因啟動子甲基化的改變，而CAG作為一種癌前病變，可會存在Runx3基因甲基化的改變，本研究也已證實Runx3啟動子CpG島甲基化陽性表達率在CAG患者明顯高于胃黏膜正常組（P＜0.05），且重度及中度胃黏膜改變組甲基化率明顯高于正常組和輕度改變組（P＜0.05），但胃黏膜輕度改變組與正常組之間，中度改變組與重度改變組之間無顯著性差異，可見隨著胃黏膜損傷嚴重程度的增加，啟動子甲基化水平明顯的增高。

此外本研究也已發現隨著胃黏膜損傷程度的增加會伴有Runx3蛋白分泌量的降低，特別是中度及重度胃黏膜改變的CAG患者，與甲基化程度呈明顯的負相關。

總之，隨著胃黏膜損傷的改變，Runx3基因啟動子甲基化可明顯的升高，且其甲基化的改變可能是蛋白表達缺失的主要原因，因此Runx3基因啟動子甲基化可作為估計胃黏膜損傷程度的生物標志物，有助于胃黏膜損傷的早期診斷，從而盡早的選取合理的臨床治療方法，降低所致胃癌的發病率。

[1] 姜貽興.慢性非萎縮性胃炎的飲食和環境因素分析[J].中國醫藥指南,2011,21(1):73-76.

[2] 康文全,趙成忠,張厚德,等.慢性非萎縮性胃炎與組織學、幽門螺桿菌、胃泌素和表皮生長因子相關性研究[J].胃腸病學和肝病學雜志,1999,2(1):102-105.

[3] 鄭小梅,伍寧豐.DNA甲基化作用的生物學功能[J].中國農業科技導報,2009,11(1): 33-39.

R573.3+<2 文獻標識碼：B class="emphasis_bold">2 文獻標識碼：B 文章編號：1671-8194（2014）17-0131-022 文獻標識碼：B

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