大鼠脊髓半橫斷損傷對脊髓神經元EGFL7表達的影響

萬 一黃純海* 張 方田 志張晶晶

（1 吉首大學第一附屬醫院神經外科，湖南 吉首 416000；2 吉首大學第一附屬醫院康復科，湖南 吉首 416000）

大鼠脊髓半橫斷損傷對脊髓神經元EGFL7表達的影響

萬 一1黃純海1* 張 方2田 志1張晶晶1

（1 吉首大學第一附屬醫院神經外科，湖南 吉首 416000；2 吉首大學第一附屬醫院康復科，湖南 吉首 416000）

目的探討和分析大鼠脊髓半橫斷損傷對脊髓神經元EGFL7表達的影響。方法65只成年SD大鼠，隨機分為正常對照組、假手術組、脊髓損傷組；建立脊髓半橫斷損傷模型（胸9～胸10），免疫組化法檢測大鼠脊髓EGFL7表達。結果未發生脊髓損傷，EGFL7表達于腹角Ⅸ板層的運動神經元和背角Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ板層的小神經元；脊髓半橫斷損傷后，灰質神經元EGFL7表達水平隨著時間逐漸增加，7 d達到高峰，隨后降低，21 d后維持穩定；脊髓損傷組脊髓神經元EGFL7免疫組化IRS評分與對照組比較具有差異統計學意義（P＜0.05）。結論EGFL7的表達變化與脊髓運動功能改變具有相關性，其可能參與脊髓損傷再生修復過程。

類表皮生長因子域7；脊髓損傷；大鼠

經研究表明，缺氧預處理大鼠腦組織EGFL7表達顯著上調并伴隨微血管密度增加[1,2]；氧暴露新生大鼠的肺組織內皮細胞中明顯下降，減少氧暴露可回復正常表達水平；在體外培養的人內皮細胞中，高氧暴露明顯下調EGFL7表達，EGFL7表達與缺氧及其誘導的血管新生過程相關。因此，本研究通過建立實驗性大鼠脊髓半橫斷損傷模型，免疫組化法分析急性期和恢復期神經元組織EGFL7表達變化和下肢功能恢復狀況，進而探討EGFL7在脊髓損傷急性期的神經元功能維持和神經元損傷修復過程的作用，為進一步探討脊髓損傷再生修復的分子機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物分組和模型構建

成年的健康清潔級雄性SD大鼠65只，體質量為（205.6±26.3）g，按隨機分為3組，分別是正常對照組（5只）、假手術組（30只，分別于2、3、7、14、21、30 d進行脊髓樣本取材，每個時間點取5只）、脊髓損傷模型組（30只，分組大鼠數量同假手術組）。戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，于胸9～10節段水平制作脊髓半橫斷損傷模型，假手術組不損傷脊髓，僅剪開硬脊膜后縫合。

1.2 灌注、固定及取材

脊髓半切損傷建模手術后，于術后2、3、7、14、21、30 d分別進行脊髓組織取材。按常規動物取材方法，戊巴比妥鈉麻醉大鼠，開胸、于胸9～10節段選取脊髓組織，福爾馬林固定、石蠟包埋、連續切片，取首尾各一張切片，常規蘇木精-伊紅染色行顯微鏡下觀察確定該系列連續切片為相應脊髓神經元組織，切片用于后期的免疫組化分析。

1.3 免疫組化染色及結果判定

常規HE染色連續切片證實的脊髓神經元的組織切片行免疫組化染色（ABC法）。大鼠EGFL7-抗為上海生工產品（濃度為1∶500）4 ℃置2 d；二抗（1∶200）37 ℃置1.5 h，DAB顯色5 min，蘇木素復染，自來水沖洗藍化，梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片。結果判定及計數，鏡下觀察，胞質呈棕黃色為EGFL7免疫陽性細胞。以中央管為中心，與脊髓前后正中溝相垂直作一直線，每只大鼠隨機取5張切片，在光鏡下計數其中一邊腹側灰質中有明顯細胞核的陽性細胞數，陽性產物表現為境清楚突出背景棕黃色或棕褐色顆粒。脊髓免疫組化計分采用IRS法，并略作修改：在高倍鏡（×200）計數前角細胞陽性細胞數，根據染色強度、陽性細胞數和二者計分的乘積進行綜合判斷，圖像分析采用試用版Image-Pro Plus 6.0軟件。

1.4 統計學分析

應用SPSS13.0 進行分析，采用百分比、均數、標準差進行描述性統計，組間比較應用卡方檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

對照組、假手術組（2、3、7、14、21、30 d）、脊髓半橫斷損傷組（2、3、7、14、21、30 d）灰質神經元EGFL7的免疫組化IRS評分比較（表1）。

表1 灰質神經元EGFL7的免疫組化IRS評分比較（n=65）

3 討 論

EGFL7是一種新發現的由特異性內皮細胞分泌的血管活性因子，其基本生理功能是胚胎發育和血管損傷時促進血管生成。然而，隨著研究深入發現EGFL7也在多種細胞類型中存在表達，包括胚胎干細胞、精原細胞、大腦皮質神經元及某些上皮源性惡性腫瘤細胞等。大量的研究結果和本研究組前期研究結果均提示，EGFL7表達與缺氧及其誘導的血管新生過程密切相關。脊髓半橫斷損傷過程伴隨最顯著的病理生理過程即存在缺血缺氧損傷過程，缺氧所誘導的新生血管廣泛存在于脊髓半橫斷損傷修復過程。因此，我們通過建立實驗性脊髓半橫斷損傷模型并采用同期BBB功能評定法和EGFL7染色免疫組化法定量分析脊髓半橫斷損傷修復過程中EGFL7表達與脊髓損傷修復的相關性。

本研究結果提示，EGFL7可能在維持正常脊髓神經元功能及損傷后的修復的一種潛在的脊髓神經可塑性調節因子，但在正常脊髓神經元中是否具有參與調節神經可塑性和維持足夠數量神經元存活的作用還需進一步證實。本研究發現，在脊髓半橫斷損傷后，EGFL7表達從3 d后顯著上調，一直持續到傷后21 d（表1），其表達水平與大鼠的后肢運動功能恢復呈顯著負相關（R2=0.619，r=-0.787，P=0.016）。該結果提示，EGFL7可能參與脊髓神經損傷修復和可塑性調節過程。EGFL7的功能具有組織和細胞特異性，其功能可能涉及神經細胞分化、細胞黏附、缺氧存活、血管生成，以及免疫調節等病理和生理過程。本研究結果提示，脊髓損傷后的運動功能修復過程與脊髓神經元表達EGFL7水平呈現明顯的負相關，其機制可能在于血管損傷或缺氧刺激神經元表達EGFL7，進而調節血管內皮細胞的群集性遷移而參與血管新生。

綜上所述，本文結果初步提示，EGFL7可能參與維持正常脊髓神經元功能，并可能在脊髓損傷后運動功能恢復過程中發揮作用。

[1] Fitch MJ,Campagnolo L,Kuhnert F,et al.Egfl7,a novel epidermal growth factor-domain gene expressed in endothelial cells[J].Dev Dyn,2004,230(2):316-324.

[2] Gustavsson M,Mallard C,Vannucci SJ,et al.Vascular response to hypoxic preconditioning in the immature brain[J].J Cereb Blood Flow Metab,2007,27(5):928-938.

R651.2

B

1671-8194（2014）17-0079-02

湖南省科技廳科技計劃項目（應用基礎研究科技專項：2011FJ6050）；湘西州科技計劃項目

*通訊作者：E-mail:huangchunhai2001@126.com