益精方對小鼠精子線粒體功能的影響

李 柱羅少波張金穎賈金銘胡海翔

1. 空軍總醫院康復醫學科（北京 100142）;

2. 中國中醫科學院廣安門醫院南區男科; 3. 中國中醫科學院廣安門醫院男科

益精方對小鼠精子線粒體功能的影響

李 柱1羅少波2張金穎2賈金銘3*胡海翔1

1. 空軍總醫院康復醫學科（北京 100142）;

2. 中國中醫科學院廣安門醫院南區男科; 3. 中國中醫科學院廣安門醫院男科

目的觀察益精方對環磷酰胺所致少弱精子癥模型小鼠精子線粒體功能的影響。方法將 40只雄性昆明小鼠隨機分為對照組（CG）、模型組（MG）、小劑量中藥治療組（SG）和大劑量中藥治療組（LG）。按60mg/kg體質量給CG小鼠腹腔注射生理鹽水（NS），給MG、SG、LG小鼠腹腔注射環磷酰胺，每天1次，連續5d，第6天開始按體質量分別給SG和LG小鼠灌服益精方，劑量分別為人類常規用量（以60 kg為標準）的1倍和5倍，MG小鼠給予等體積的NS灌胃，每天1次， 連續34 d，CG常規飼養，然后對小鼠進行精液常規分析，流式細胞術檢測精子線粒體功能。結果CG、MG、SG和LG 組小鼠附睪精子密度分別為（5.20±1.34）、（1.73±0.03）、（2.08±0.01）、（3.31±0.56）×106/mL；精子活力[（a+b）級精子百分率]分別為（14.49±0.30）%、（6.64± 1.88）%、（11.99±1.01）%、（19.40±3.13）%；精子活率[（a+b+c）級精子百分率]分別為（68.39±15.13）%、（39.96±4.89）%、（62.28±4.43）%、（73.61±5.05）%。MG組精子密度、精子活力、精子活率顯著低于CG組（P＜0.05）；經治療后LG組精子密度、精子活力和精子活率明顯增加，與MG組比較有顯著性差異（P＜0.05），而與CG組在精子活力和精子活率上沒有明顯區別。在CG、MG、SG和LG組，線粒體功能良好精子的百分率分別為（1105.93±0.33）%、（848.55±6.15）%、（888.77±22.46）%、（1000.885±72）%，線粒體功能喪失精子的百分率分別為（27.94±0.32）%、（42.43±1.00）%、（35.11±1.23）%、（30.91±0.44）%，MG小鼠精子線粒體功能良好的表達量明顯下降，而線粒體功能喪失的表達量明顯增多，與CG小鼠比較均有明顯差異（P＜0.05）； 經治療后，LG小鼠精子線粒體功能良好的表達量顯著性增加（P＜0.05），同時線粒體功能喪失的表達量明顯減少，與MG小鼠比較有明顯差異（P＜0.05）。結論腹腔注射環磷酰胺可使小鼠精子密度、精子活力、精子活率降低，大劑量益精方可以增加小鼠精子密度，并增加精子線粒體功能，提高精子活力和精子活率，從而達到治療少弱精子癥的目的。

益精方; 線粒體; 弱精子癥; 小鼠

我國育齡夫婦患不育癥的發病率在10%左右，并有增加的趨勢，其中因男性生育能力缺欠所致的不育癥約占50%[1]。以“益精方”為代表的中醫藥治療男性不育癥之少弱精子癥療效明顯[2,3]，但其治療機制一直不甚明了，本研究試圖從精子線粒體功能的角度對其治療弱精子癥的機制進行解讀。

材料與方法

一、實驗動物及分組

清潔級雄性昆明小白鼠40只（購于中國醫學科學院實驗動物研究所），體重18～20 g，采用數字法隨機分為對照組（control group, CG）、模型組（model group, MG）、小劑量中藥治療組（small dose group, SG）、大劑量中藥治療組（large dose group, LG），每組10只。

二、主要器材

流式細胞儀：美國B D公司產品，型號：FACSCalibur; Allagra.21R Centrifcige高速冷凍離心機（德國BACKMAN公司）；DU640型紫外線分光光度計（德國BACKMAN公司）；WL-9000型偉力精子分析儀（北京偉力新世紀科技發展有限公司）；DRHW-1型恒溫水浴箱（北京市醫療設備總廠）等。

三、主要試劑

羅丹明123（Rhodamine 123,Rh123）和碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）：均為Sigma公司產品，Rh123，Cat：R8004，用蒸餾水配制為1 g/L儲存液，0～4℃避光保存備用；PI，Cat：P4170。

BWW低蛋白培養液、BWW高蛋白獲能液：NaCl 554 mg/100 mL，KCl 35.6 mg/100 mL，KH2PO416.2 mg/100 mL，NaHCO3210 mg/100 mL，葡萄糖100 mg/100 mL，丙酮酸鈉 3 mg/100 mL，乳酸鈉 370 μl/100 mL，慶大霉素 125 μl/100 mL，0.5%酚紅 50 μl/100 mL。精子處理用含0.3%人血清白蛋白的BWW低蛋白液，精子獲能用含3.5%人血清白蛋白的BWW高蛋白獲能液。

孵育緩沖液：10 mmol/ L HEPES、140 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L CaCl2，pH =7.4。

PBS液：8g/L NaCl、0.2 g/L KCl、1.44 g/L Na2HPO4?7H2O、 0.24 g/L KH2PO4?H2O、 pH =7.2。

四、實驗用藥

“益精方”主要成分：當歸、紅花、五味子、菟絲子、桑葚、桑螵蛸、炒蒼術、仙靈脾、肉蓯蓉、韭菜子、黃精、玉竹、熟地等，每付藥材中含生藥199g，按常規方法煎熬并濃縮成含生藥1g/mL的藥液，冷藏于4℃冰箱備用。

五、方法

實驗小鼠適應性馴養5 d后，根據文獻報告[4]及預實驗的結果，CG按體質量60 mg/kg腹腔注射生理鹽水（NS），MG、SG、LG按體質量60 mg/kg腹腔注射環磷酰胺，每天1次，連續5 d。從第6天開始給予治療藥物（記為d1，以后按時間順序依次記錄為d2、d3……）以人體60 kg為標準，按體質量分別給SG和LG小鼠灌服“益精方”，劑量分別為人類常規用量（每天每公斤體質量消耗生藥量約為3.3 g）的1倍和5倍并用NS將藥液體積調配成相同大小，MG小鼠給予等體積的NS灌胃，每天1次，共灌胃34 d。灌胃期間，每周給小鼠稱量1次，并根據新的體重調整灌胃藥量。灌胃結束后的第二天將實驗小鼠處死后迅速摘取睪丸、附睪、輸精管，迅速剝除粘連的血管、韌帶及脂肪等組織，備用。

（一）小鼠精子的采集

雙側附睪置于潔凈培養皿中，用眼科剪沿附睪縱軸剪一刀使其分為大致均勻的兩半，然后沿橫軸剪兩刀使附睪分為大致均勻的6段，將剪碎的附睪組織移入預置常溫孵育緩沖液1 mL的試管中，然后用1 mL孵育緩沖液沖洗培養皿，沖洗液移入裝附睪的試管中。

摘取睪丸和附睪后，分離輸精管，于輸精管與附睪尾結合部、輸精管與前列腺結合部剪切離斷輸精管。用胰島素注射針抽取孵育緩沖液1 mL，沿輸精管一側斷端將針頭插入輸精管管腔內，輕推注射器，可見另一側斷端流出1～2滴乳白或灰白色液體，內含大量精子，將所得液體滴入裝附睪的試管中，并用注射器中剩余孵育緩沖液沖洗輸精管管腔，并將液體全部滴入裝附睪的試管中。將所得精子置于37℃恒溫孵育箱中孵育30 min備用。

（二） 精子常規分析

精子于37℃恒溫孵育箱中孵育30 min后，小心吸取上層液體，360×g，離心5 min，沉淀物加入1 mL BWW高蛋白獲能液，置于37℃恒溫孵育箱中獲能2 h，參照人類精子分析方法用偉力精子分析儀對精子密度、精子活力等進行常規分析。

六、精子線粒體功能測定

精子于37℃恒溫孵育箱中孵育30min后，小心吸取上層液體，360×g，離心5min，沉淀物加入PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）洗滌2次后離心360×g，離心5min。PBS懸浮沉淀精子，調精子密度為1×106/m，加入Rh123（終濃度10μg/mL），置于37℃水浴孵育10 min，離心棄上清， PBS重復洗滌離心2次， PBS懸浮，加入PI（終濃度10μg/mL）染色5 min，上流式細胞儀檢測。

七、統計學分析

使用SPSS11.5軟件對正態分布數據進行ONEWAY ANOVA檢驗，數據用±s表示。P＜0.05為有顯著性差異。

結 果

一、小鼠附睪精子常規檢查結果

結果表明，與C G比較，M G精子密度、精子活力[（a+b）級精子百分率]、精子活率[（a+b+c）級精子百分率]顯著下降（P＜0.05）；與MG比較，LG精子密度、精子活力、精子活率有明顯升高（P＜0.05），見表1。

表1 小鼠精子密度、活力及活率比較（±s, n=10）

表1 小鼠精子密度、活力及活率比較（±s, n=10）

注: 與CG比較, :P＜0.05; 與MG比較, #:P＜0.05; 與SG比較, :P＜0.05

度(×106/mL) (a+b)級精子(%)組別 精子密(a+b+c)級精子(%) CG 5.20±1.34 14.49±0.30 68.39±15.13 MG 1.73±0.03*6.64±1.88*39.96±4.89*SG 2.08±0.01*11.99±1.01 62.28±4.43#LG 3.31±0.56*#19.40±3.13#▲73.61±5.05#*▲

二、線粒體功能測定結果

結果表明，與CG比較，MG小鼠精子線粒體Rh123表達明顯下降，而PI表達明顯增多（P＜0.05）；與MG比較，LG小鼠精子線粒體RH123表達顯著性增加，同時PI表達明顯減少（P＜0.05），見表2，圖1。

表2 線粒體功能測定結果比較（±s , n=10）

表2 線粒體功能測定結果比較（±s , n=10）

注: 與CG比較,*:P＜0.05; 與MG比較, #:P＜0.05; 與SG比較,▲:P＜0.05; Rh123%: 線粒體功能良好的精子百分數; PI%: 線粒體功能喪失的精子百分數

Rh123% PI% CG 1105.93±0.33 27.94±0.32 MG 848.55±6.15*42.43±1.00*SG 888.77±22.46*35.11±1.23*# LG 1000.885±72*#▲30.91±0.44*#▲

討 論

精子運動依賴線粒體提供能量，當精子線粒體功能異常，其能量合成減少，導致了精子活動力減弱。線粒體功能是通過氧化磷酸化合成ATP，為精子運動提供能量，而ATP合成過程與線粒體內電子傳遞有關。因此精子線粒體結構是否完好以及線粒體DNA是否受損，將影響到線粒體內ATP能量合成，進而影響精子活力、活率甚至精子的存活。

圖1 線粒體功能散點圖

環磷酰胺為目前廣泛應用的烷化劑類抗腫瘤藥物，其進入體內被肝臟或腫瘤內過量的磷酰胺酶或磷酸酶水解，變為有活性的磷酰胺氮芥，與DNA 發生交叉聯結，抑制DNA的合成，也可干擾RNA的功能，可對人體多系統產生毒副作用[5]。環磷酰胺腹腔注射后，模型組小鼠出現精子活力和活率明顯下降，出現明顯的弱精子癥表現，這一作用可能與精子線粒體功能損傷有關。

本實驗表明，造模后小鼠線粒體功能良好的精子百分數（Rh123%）明顯下降，而線粒體功能喪失的精子百分數（PI%）明顯增多，與空白組小鼠比較均有明顯差異（P＜0.05）；經“益精方”治療后，線粒體功能逐漸好轉，大劑量組小鼠線粒體功能良好的精子顯著性增加（P＜0.05），同時治療后線粒體功能喪失的精子明顯減少，與模型組小鼠比較有明顯差異（P＜0.05）。

“益精方”是賈金銘主任治療少、弱精子癥的系列方劑之一，在臨床治療中療效可靠[2,3]。根據中醫理論，當歸為補血活血之圣藥，功用補血活血，調經止痛；菟絲子為傳統男性不育古方“五子衍宗丸”之主藥，入腎填精；紅花與當歸合用，瘀去而新生，精血充沛而不滯；桑葚固精縮尿，補腎助陽，益精生子；桑螵蛸滋陰補血，生精潤燥；熟地補血滋陰、益精填髓，共同輔佐菟絲子達到補腎填精的效果。仙靈脾補腎壯陽，益命門之火；肉蓯蓉補腎陽、益精血、暖腰膝；韭菜子補肝腎，暖腰膝，三藥合用，溫養腎陽，使精子活動能力增加。黃精、玉竹益氣滋陰，五味子收斂固澀，益氣生津，蒼術燥濕健脾。全方以當歸、菟絲子為君，以紅花為臣輔助當歸養血活血化瘀，以熟地、桑葚、桑螵蛸為臣輔助菟絲子以補腎填精，同時以仙靈脾、肉蓯蓉、韭菜子為臣溫腎助陽以壯腎氣，佐以五味子收斂、蒼術燥濕健脾，共湊活血養血、補腎生精之功。

現代研究表明，方中藥物能從不同靶點角度改善睪丸、附睪和精子的功能。當歸[6]能改善外周循環，能促進細胞再生和恢復，對非特異性和特異性免疫功能均有增強作用；與紅花同用，達到改善睪丸局部微循環，促進活性氧自由基（reactive oxygen species, ROS）清除，增加精子生成的目的。菟絲子水煎劑能明顯增強黑腹果蠅交配次數，菟絲子水提物對ROS所致人精子膜損傷有保護作用[7]；仙靈脾[8,9]能改善下丘腦-垂體-性腺軸的功能；肉蓯蓉[10-12]能抗氧化抗衰老；韭菜子[13-15]中鐵、鋅、鎂、鈣含量豐富，能抗氧化，增加睪丸、附睪、精囊腺的質量；熟地[16,17]能提高單核細胞的活性，提高機體抗疲勞、抗衰老及清除自由基的能力；桑葚[18,19]富含鎂、鐵、鋅等微量物質，能降低血清總膽固醇、甘油三酯水平，促進血液循環；桑螵蛸[20,21]富含人體必需的8種氨基酸、磷脂，能增強機體抗疲勞能力，提高睪丸指數。諸藥合用，從多系統、多靶點對男性生殖功能產生作用，促進精子生成、改善精子活力，其作用的具體過程尚需進一步研究。

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（2014-06-26收稿）

Effects of Yijingfang on mitochondrion in the mouse model of cyclophosphamide-induced oligoasthenospermia

Li Zhu1, Luo Shaobo2, Zhang Jinying2, Jia Jinming3*, Hu Haixiang1
1. Deptment of Rehabilitation Medicine，General Hospital of Air Force PLA, Beijing 100142, China;
2. Department of Andrology, Guang'anmen Hospital South Area; 3. Department of Andrology, Guang'anmen Hospital

Jia Jinming, E-mail: nanke1145@126. com

ObjectiveTo observe the effects ofYijingfangon the mitochondrion in the mouse model of cyclophosphamide-induced oligoasthenospermia.MethodsForty Kunming male mice were randomly divided into four groups such as the control group (CG), the model group (MG), small-doseYijingfanggroup (SG), and large-doseYijingfanggroup of (LG). The mice of CG were intraperitoneally injected with normal saline at 60 mg/kg once a day ,while those of MG, SG and LG with cyclophosphamide, all for 5 days. During the next 34 days, the mice of SG and LG received intragastric administration ofYijingfangonce a day, the former at a dose 2times and the latter 5 times that of human routineusage, those of MG given the same volume of normal saline, and CG normally fed. At 35 days, we measured the sperm count, percentages of grades a+b and a+b+c sperm, and the function of mitochondrion in the epididymal sperm of the mice.ResultsThe sperm counts of CG, MG, SG and LG were(5.20±1.34), (1.73±0.03), (2.08±0.01) and (3.31±0.56)×106/mL, respectively, and sperm number was signif cantly lower in MG than that in CG (P<0.05), but higher in LG than that in MG (P<0.05). The grade a+b sperm constituted (14.49±0.30), (6.64±1.88), (11.99±1.01) and (19.40±3.13)% in CG, MG, SG and LG, respectively, and the grade a+b sperm was remarkably lower in MG than that in CG (P<0.05), but higher in LG than that in MG(P<0.05); the grade a+b sperm accounted for (68.39±15.13), (39.96±4.89), (62.28±4.43) and (73.61±5.05)%, respectively, and it was obviously lower in MG than that in CG (P<0.05) but higher in LG than that in MG (P<0.05); the percentages of good function mitochondrion were (1105.93±0.33)%, (848.55±6.15)%, (888.77±22.46)% and (1000.885 ±72)% in CG, MG, SG and LG, respectively, and it was remarkably lower in MG than that in CG (P<0.05), but higher in LG than that in MG(P<0.05); defuctionalization mitochondrion were (27.94±0.32)%, (42.43±1.00)%, (35.11±1.23)% and (30.91±0.44)%，respectively, it was remarkably higher in MG than that in CG (P<0.05), but obviously lower in LG than that in MG(P<0.05).ConclusionIntraperitoneal injection of cyclophosphamide decreases the sperm count, percentages of grades a+b and a+b+c sperm, and the function of mitochondrion in mice, while large-doseYijingfangcan improve the above parameters, and contributes to the treatment of oligoasthenospermia.

Yijingfang; mitochondria; asthenozoospermia; mice

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.10.003

R 698.2

*通訊作者, E-mail: nanke1145@126. com