非梗阻性不育患者精子超微結構的研究

葛少欽王 然郭明申劉淑卓殷慧穎

1. 河北大學基礎醫學院（保定 071000）; 2. 河北大學生命科學學院; 3. 河北大學附屬醫院

·研究簡報·

非梗阻性不育患者精子超微結構的研究

葛少欽1王 然1郭明申2劉淑卓3殷慧穎1

1. 河北大學基礎醫學院（保定 071000）; 2. 河北大學生命科學學院; 3. 河北大學附屬醫院

當今社會中不孕不育夫婦數量正逐步增加[1]。據統計，全世界大約有15%～20%的育齡夫婦存在生育障礙，其中男性原因導致不育的比例占40%～50%[2]。

精子形態異常、精子畸形率增加是導致男性不育的重要原因[3]。近幾年來研究發現不育男性精子不僅存在光鏡形態學異常，而且精子的超微結構也發生了病理性改變。鑒于諸多精子超微結構研究過程中，存在精子超微結構特征描述不系統、不同形態精子超微結構描述不全面等問題，本文利用透射電鏡技術對臨床非梗阻性不育患者精液精子進行觀察，努力發現患者不同形態精子超微結構的細微缺陷，在精子超微結構水平分析患者不育原因，預測男性潛在的生育能力，從而指導臨床診斷，為病人選擇最佳的治療方案[4]。

材料與方法

一、受試對象

受試對象為結婚2年，女方生殖系統功能正常，非梗阻性男性不育患者6例，按男性病實驗診斷標準檢測；正常對照組為結婚2年，孕育有孩子，正常生育男性3例。

二、標本采集和處理

禁欲一周后，在室溫25～30℃的實驗室內，由供精者按摩取精。待精液自動液化后，緩慢注入離心管中，以1 850×g，離心10min，用吸管輕輕吸出精漿，沉淀精子用瓊脂糖進行預包埋，戊二醛固定液固定1h后，PBS緩沖液（pH=7.2）洗滌3次，每次10min，鋨酸固定1h，然后用Epon812環氧樹脂包埋，半薄切片用甲苯胺藍染色，光鏡下進行半薄定位，切超薄切片用鉛鈾雙染，透射電鏡下觀察。

三、觀察指標

透射電鏡下主要觀察精子的質膜、頂體、精子核、精子頸部、線粒體和微管等病理性改變。

結 果

通過透射電鏡觀察，正常精子的質膜和頂體雙層膜結構完整清晰（圖1A、圖1B），精子核呈梨狀形，核染色質電子密度均勻一致，尾部線粒體大小形態一致，排列規律（圖1C），精子尾部微管9+2結構完好（圖1D）。

圖1 正常形態精子的超微結構

在這6例男性不育患者的精液中幾乎都可見精子超微結構不同程度的結構異常，正常精子極其少見。畸形精子不僅僅是存在一種病變，大多數是多種結構異常并存。

一、質膜的異常

患者精子質膜大多出現了病變，表面粗糙。質膜邊緣可與頂體前膜融合變得模糊不清（圖2A），質膜腫脹破損（圖2B），多處出現大小不等的囊泡（圖2C）甚至質膜缺失（圖2D）等。

二、頂體的異常

有些精子頂體腫脹變形及產生褶皺，頂體雙層膜結構可呈不平行或波浪狀改變（圖3A），外膜彎曲和不連貫，嚴重者頂體內外層膜破損，內容物溢出，有些頂體內容物疏松呈低電子密度（圖3B），頂體后環部分缺失（圖3C），頂體邊緣卷曲，頂體下間隙增大，遠離精子核（圖3D）等。

圖2 精子質膜的異常

圖3 精子頂體的異常

三、精子核的異常

精子核異常的精子經常表現為頭部形態的異常，在本例患者中錐形頭畸變精子居多（圖4A）。核濃縮異常，電子密度增高，核周出現囊性空泡，空泡與頂體內膜相融合（圖4C），個別精子細胞核出現巨型空泡（圖4B），空泡間有膜性結構（圖4D）。另外，在觀察到的未發育成熟精子中可見未分離的多核精子（圖5A）。

四、精子頸部的異常

頭部畸形的精子伴有頸部變形腫脹，存在胞質小滴（圖5B）等。

五、線粒體的異常

多數精子可見其尾部軸絲兩側的線粒體數減少，線粒體分布不均，大小不一，疏密不均（圖3C、圖5C）；不育患者精子線粒體腫脹變形，嚴重腫脹的線粒體發生線粒體內空泡化，形成微囊，囊內可見高電子密度膜狀物（圖5D）；出現雙層或三層重疊線粒體圍繞于軸絲（圖6A、圖6B）等。

六、微管異常

尾部橫斷面見微管系統錯位，模糊不清，有些微管與纖維鞘融合呈高電子密度，軸絲異常2+9結構紊亂異常，周圍微管或中央微觀有缺失（圖3B、圖6C、圖6D）等。

圖4 精子核的異常

圖5 精子核、頸部及線粒體的異常

圖6 精子線粒體、微觀的異常

討 論

通過電鏡與正常生育男性精液中精子的形態相比較，發現非梗阻性不育患者精液精子以錐形頭居多，且超微結構幾乎都有不同程度的損傷，這與常規精液檢查中其精子畸形率偏高相一致。更值得注意的是，畸形精子不僅僅是存在一種病變，大多數是多種結構異常并存，而發生單一病變者比較少見。精子結構的正常是保證受孕的基礎，嚴重頭部畸形精子可導致低受精率、著床率和妊娠率[5]，精子超微結構的異常與男性不育密不可分。精子的質膜、頂體、精子核、線粒體、微管等任何一個結構發生病變都將會影響受精。

完整的質膜在把信息從精子外傳到精子內的過程中，起著重要作用。一般認為精子頭的前半部分精子膜參與頂體反應，頂體后區的精子膜能識別卵子，并能與卵子的細胞膜相結合。電鏡下觀察到的質膜的腫脹、破損、缺失等病變（圖2A～圖 2D），會影響精子受精。

頂體在受精過程中扮演著非常重要的角色，它是一種特化的溶酶體，內含多種酶類如透明質酸酶、乳酸脫氫酶等。當精子和卵細胞相遇時頂體通過小孔釋放透明質酸酶，降低宮頸黏液的黏度，使精子能穿透卵細胞的放射冠和透明帶進入細胞內，完成受精過程[6]。在電鏡下觀察到不育男性患者的一些精子在頂體結構方面受到嚴重損傷，精子頂體腫脹變形、內外膜破損嚴重（圖3A、圖3B），會使酶系統受到抑制，頂體喪失了正常生理功能。另外還發現有的精子頂體后環有部分缺失（圖3C），頂體后環相應部分的精子膜有識別卵細胞膜的功能，并與之相融合，缺乏頂體后環，即使精子與卵細胞相遇也達不到受精的目的，這可能是導致該男性不育的又一重要原因。

精子核是遺傳物質的所在地，對受精卵的發育是非常重要的。在電鏡下可觀察到患者的精子核增長，錐形頭多見（圖4A）。盡管精子核增長的機制尚未闡明，研究人員認為其有可能與染色體的異常，如染色質凝聚狀態的改變、染色體的異倍性改變有關[7]。另外發現某些精子細胞核內有空泡形成（圖4B～圖4D），核內空泡是在染色質濃縮過程中形成，一般不會影響精子的受精能力，但是我們在電鏡下發現病人精子核內出現巨型空泡（圖4D），體積約占核的2/3，空泡體積增大可能是染色質正常排列發生明顯畸變的結果，且被視為精子染色質成熟度和濃縮異常[8]，可增加精子成熟障礙，影響精子的受精能力。

胞質小滴是生殖細胞胞漿殘余物，大部分被睪丸支持細胞吞噬。在電鏡下可觀察到精子頸部腫脹，存有殘留物（圖5B）。過多殘留物的存在與精子的不成熟特別是活性氧的產生有關[9]，進而導致精子DNA損傷、內分泌激素異常和畸形精子的生成[10,11]，可導致精子功能下降，引起男性不育。

線粒體的功能是通過氧化磷酸化合成ATP，為精子的運動提供能量，在電鏡下可觀察到患者的精子的線粒體排列不均，大小不一，發生腫脹變形、空泡樣等病變（圖5C、圖5D、圖6A和圖6B）。當精子線粒體發生異常后，將影響線粒體內ATP能量的合成和線粒體自身復制的正確性，同時伴隨著各種能量代謝酶的改變，如琥珀酸脫氫酶、細胞色素氧化酶等含量的改變，導致精子能量正常供應受影響，精子活動力減弱，進一步影響精子的存活[12]，另有研究表明缺乏活動力的精子其受孕率僅21%[13]，因此認為線粒體的異常是影響男性不育的主要原因之一。

微管通過肌動蛋白和肌球蛋白的滑動來操控精子尾部運動[14]，微管是精子運動的物質基礎，可為精子提供動力，保證精子能順利到達受孕處。在電鏡下可觀察到不育患者的精子微管存在損傷、缺失，尾部橫斷面可以清晰可見9+2結構有缺失，微管系統模糊不清（圖3B、圖6C圖和圖6D），這會導致精子運動能力不足，這也是男性不育的一個重要原因[15]。

總之，男性不育與精子的超微結構的改變密切相關，本實驗對非梗阻性男性不育患者精液進行電鏡觀察，與正常生育男性精液進行比較，結果顯示男性不育患者精子超微結構存在多處病變，表明精子超微結構異常系非梗阻性男性不育原因之一。

目前臨床不育檢查以精液常規檢查結果為主，在光鏡下觀察，僅對精子的形態進行分類，只能對精子質量有大致了解，通過電鏡的觀察，能了解精子內部許多亞細胞結構的變化與缺陷，可進一步分析不育患者的成因，因此電鏡是目前精子形態學檢測最客觀可信的依據[16]。通過電鏡觀察精子的超微結構，不僅有助于結束患者長期盲目的不育治療和檢查，提高臨床診斷和治療的水平，而且還能為精子內部超微結構的變化與男性生育力強弱間的關系提供基礎理論依據[17]。

男性不育; 精子/超微結構

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（2013-10-28收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.03.016

R 698.2