抗炎治療對白細(xì)胞精液癥患者精漿瘦素與活性氧的影響分析*

張 濤 陳 斌呂逸清 王鴻祥 胡 凱 金 炎

楊 昊 馮 坦 朱 宏 黃燕平 韓銀發(fā) 王益鑫 黃翼然

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院泌尿外科，上海市男科學(xué)研究所（上海 200001）

抗炎治療對白細(xì)胞精液癥患者精漿瘦素與活性氧的影響分析*

張 濤 陳 斌**呂逸清 王鴻祥 胡 凱 金 炎

楊 昊 馮 坦 朱 宏 黃燕平 韓銀發(fā) 王益鑫 黃翼然

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院泌尿外科，上海市男科學(xué)研究所（上海 200001）

目的探索抗炎治療對白細(xì)胞精液癥患者精子參數(shù)的改善情況及對精漿瘦素（Leptin）與活性氧（Reactive oxygen species, ROS）水平的影響，并分析其相關(guān)性。方法 隨機(jī)選取2010年12月至2012年6月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院泌尿男科門診的白細(xì)胞精液癥患者80例（WBC組），另選取各項(xiàng)參數(shù)均正常的40份精液標(biāo)本作為對照組，在患者治療前及經(jīng)治療精液白細(xì)胞水平恢復(fù)正常后，采用計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)（CASA）行精液常規(guī)檢測、放射免疫法檢測精漿Leptin、TBA法檢測精漿ROS。比較各參數(shù)的組間差異并分析其相關(guān)性。 結(jié)果WBC組治療前精子濃度及活力均低于對照組（P＜0.05，P＜0.01），精漿Leptin與ROS水平高于對照組（P＜0.05，P＜0.01），精漿Leptin水平與精漿ROS水平具有正相關(guān)性（r=0.695，P＜0.05），經(jīng)治療后精子活力顯著增加（P＜0.01），精漿Leptin及ROS水平亦明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論白細(xì)胞精液癥患者精漿Leptin、ROS水平均有增加，精子易受到氧化損傷導(dǎo)致其密度、活力下降，精漿Leptin與ROS水平之間存在正相關(guān)性，提示Leptin可能參與了氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致精子濃度和活力的下降。

白細(xì)胞精液癥; 瘦素; 活性氧

白細(xì)胞精液癥是指精液中白細(xì)胞數(shù)量超過1× 109個(gè)/L，通常由生殖系統(tǒng)感染引起，是導(dǎo)致精液質(zhì)量下降和男性不育的重要病因之一[1]。白細(xì)胞可通過吞噬作用、產(chǎn)生活性氧（ROS）及分泌某些細(xì)胞因子等多種途徑損傷精子的活力和功能，其產(chǎn)生ROS的能力比精子要強(qiáng)很多[2]。瘦素（Leptin）是一種主要由白色脂肪組織所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)類激素，主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)機(jī)體的能量代謝，此外，其在青春期啟動、血管生成、免疫功能和炎癥反應(yīng)等生理活動中也起著重要的調(diào)節(jié)作用。近年來，Leptin在生殖系統(tǒng)中的作用亦被發(fā)現(xiàn)并日益成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。不少研究表明Leptin在下丘腦、垂體前葉、睪丸及精子等與男性生育密切相關(guān)的器官、組織和細(xì)胞中廣泛存在，對生精功能及精子凋亡等生理過程具有重要調(diào)節(jié)作用[3-6]。本研究通過比較白細(xì)胞精液癥患者在抗炎治療前后精子參數(shù)、精漿中Leptin和ROS的含量與正常組的差異，并分析其相關(guān)性，旨在對上述問題進(jìn)行進(jìn)一步探索。

材料與方法

一、研究對象

從2010年12月至2012年6月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院泌尿男科門診就診的男性不育患者中隨機(jī)選取白細(xì)胞精液癥患者80例（均經(jīng)過氧化物酶染色法明確診斷），作為WBC組；另選取各項(xiàng)檢測參數(shù)均正常并使女方懷孕的40份精液標(biāo)本作為對照組。

入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡為20～42歲男性。（2）性生活正常，未采取任何避孕措施2年以上未使女方懷孕，女方生育能力檢查正常。（3）體檢未發(fā)現(xiàn)明顯睪丸、附睪及輸精管異常。（4）無外傷及遺傳性疾病家族史，無性功能障礙病史。（5）患者同意參加本次研究，依從性好。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）惡性腫瘤患者正接受放療、化療者。（2）其他致男性不育因素，如成人雙側(cè)隱睪、精索靜脈曲張、染色體異常等。（3）患有急性疾病、嚴(yán)重慢性疾病及家族性遺傳病等。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）精液標(biāo)本收集

所有研究對象在留取精液前均禁欲2～7d，于本院取精室按標(biāo)準(zhǔn)步驟留取精液標(biāo)本：排尿后洗凈雙手和陰莖，以手淫法將精液完整收集于專用的廣口容器中。精液標(biāo)本取出后立即放置于37℃水浴箱內(nèi)，待精液充分液化后行精液常規(guī)分析。精液經(jīng)3000×g，離心15min后分離出精漿、精子分別存于-80℃冰箱待統(tǒng)一檢測。白細(xì)胞精液癥組患者在精液中白細(xì)胞轉(zhuǎn)陰后3個(gè)月分別再次按上述步驟留取標(biāo)本，并同樣處理保存。

（二）精液常規(guī)分析

精液標(biāo)本經(jīng)37℃水浴充分液化后，由專門檢驗(yàn)人員按照《世界衛(wèi)生組織人類精液及精子-宮頸黏液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊（第四版）》標(biāo)準(zhǔn)，先在顯微鏡下目測分析，然后使用精液分析系統(tǒng)進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助精液分析。每份標(biāo)本檢測均經(jīng)兩位檢驗(yàn)員核校。

（三）TBA法檢測精漿ROS

取各組離心分離后的精漿作為檢測標(biāo)本，采用南京建成生物工程研究所MDA試劑盒檢測，按試劑盒說明書進(jìn)行操作，在532nm處讀取吸光度值，通過（測定管-測定空白管）/（標(biāo)準(zhǔn)管-標(biāo)準(zhǔn)空白管）計(jì)算得出精漿ROS值。

（四）放射免疫法檢測精漿Leptin

選用北京福瑞生物工程公司Leptin放射免疫測定試劑盒，按試劑盒說明進(jìn)行操作，用上海核所日環(huán)光電儀器有限公司全自動放射免疫γ計(jì)數(shù)器 讀數(shù)，使用SN695B型γ放射免疫計(jì)數(shù)測量系統(tǒng)（第二版）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算樣品濃度。

結(jié) 果

一、對照組與WBC組患者基本信息

對照組年齡（27.69±6.53）歲，體質(zhì)量指數(shù)（BMI）為（21.91±0.76）kg/m2；WBC組患者年齡（28.16±7.62）歲，BMI為（22.92±0.42）kg/m2，不育年限（3.26±1.67）年。對照組與WBC組在年齡、身高、體質(zhì)、BMI方面均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

二、各組精液常規(guī)分析結(jié)果

由表1可見。各組精液pH無明顯差別（P＞0.05）。WBC患者術(shù)前精子濃度、活力及活率均低于對照組，經(jīng)治療精液中白細(xì)胞恢復(fù)正常后精子濃度、活力及活率有上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 WBC組患者手術(shù)治療前后與對照組精液常規(guī)檢測結(jié)果比較

三、精漿Leptin與ROS檢測結(jié)果

采用Mann-Whitney Test分析比較任意兩組間差異。WBC組治療前精漿Leptin水平高于治療后及對照組，精漿ROS水平顯著高于治療后及對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

四、精漿Leptin與精漿ROS水平的相關(guān)性分析

采用Spearman等級相關(guān)法分析精漿Leptin與精漿ROS水平及精子凋亡之間的相關(guān)性，結(jié)果見圖1，表3。

WBC組：精漿Leptin水平與ROS水平之間的相關(guān)系數(shù)為0.695，正相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

對照組：精漿Leptin水平與精漿ROS水平之間相關(guān)系數(shù)為0.087，無顯著相關(guān)性。

表2 各組精漿Leptin與ROS檢測結(jié)果

表3 精漿Leptin與ROS相關(guān)性分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖1 對照組（左）與WBC組（右）精漿Leptin與ROS的相關(guān)性示意圖

討 論

白細(xì)胞精液癥是導(dǎo)致男性不育的常見病因。精液中的白細(xì)胞是精漿中ROS 的主要來源，過量的白細(xì)胞可通過吞噬作用、產(chǎn)生大量ROS 等方式損害精子質(zhì)量。ROS是需氧細(xì)胞在代謝過程中產(chǎn)生一系列活性氧簇，它們具有非常活躍的化學(xué)性質(zhì)，主要包括超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）及羥自由基（?OH）等，它們中有的可作為第二信使，把細(xì)胞外刺激信號傳遞到核內(nèi)，修飾蛋白使之磷酸化，引起級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而改變基因表達(dá)，上調(diào)如黏附分子和其他血管炎性分子的表達(dá)水平；另一方面，ROS可攻擊精子細(xì)胞膜和線粒體內(nèi)、外膜，使不飽和脂肪酸氧化，破壞脂質(zhì)雙分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致ATP生成減少，精子活力下降、死亡增加，并影響精子的頂體反應(yīng)及受精功能[7-11]。不僅如此，ROS還能引起精子染色質(zhì)異常和DNA損傷[12,13]。而上述損傷則有可能在細(xì)胞內(nèi)啟動凋亡程序，導(dǎo)致精子凋亡率的增加。

近年來多項(xiàng)研究表明局部Leptin水平升高與氧化應(yīng)激、ROS水平升高有著密切的關(guān)系。 Leptin可以在多種組織細(xì)胞中引起氧化應(yīng)激，有學(xué)者通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞中高濃度的Leptin通過上調(diào)內(nèi)皮素mRNA的表達(dá)而增加內(nèi)皮素的合成，造成微環(huán)境平衡失調(diào)從而誘發(fā)氧化應(yīng)激[14]。還有研究證實(shí)Leptin可以劑量依賴的方式增加人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，并激活JNK信號通路，增強(qiáng)活化蛋白1的DNA結(jié)合能力，從而增加單核細(xì)胞趨化蛋白1的表達(dá)[15]，并可誘導(dǎo)正常人單核細(xì)胞的呼吸爆發(fā)；在巨噬細(xì)胞中，Leptin能夠增加脂蛋白脂酶的合成，氧化應(yīng)激和蛋白激酶C參與了這一過程[16]。上述結(jié)果均說明氧化應(yīng)激是Leptin作用的一個(gè)重要效應(yīng)，本研究的結(jié)果證實(shí)白細(xì)胞精液癥患者精漿Leptin水平與ROS水平密切相關(guān)。臨床上一般通過抗感染、免疫抑制劑及手術(shù)治療等方法來去除引起氧化應(yīng)激的因素。我們的研究還發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞精液癥患者經(jīng)治療白細(xì)胞恢復(fù)正常后，患者精漿Leptin與ROS均出現(xiàn)下調(diào)且精子質(zhì)量出現(xiàn)了明顯的改善。綜合以上結(jié)果，我們認(rèn)為，Leptin可能參與了氧化應(yīng)激效應(yīng)進(jìn)而影響精子濃度、活力等參數(shù)。關(guān)于Leptin參與的氧化應(yīng)激效應(yīng)的具體機(jī)制，以及調(diào)節(jié)Leptin-氧化應(yīng)激途徑在輔助生殖中對提高受孕率、妊娠率及胚胎質(zhì)量是否有所幫助，將是值得關(guān)注和進(jìn)一步深入研究的課題。

1 Fariello RM, Del Giudice PT, Spaine DM,et al. Effect of leukocytospermia and processing by discontinuous density gradient on sperm nuclear DNA fragmentation and mitochondrial activity.J Assist Reprod Genet2009; 26(2-3): 151-157

2 呂逸清, 陳斌, 胡凱, 等. 不育癥患者精子凋亡率與精漿活性氧水平檢測及相關(guān)性分析. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)?醫(yī)學(xué)版 2009; 29(6): 705-708

3 Ahima RS, Saper CB, Flier JS,et al. Leptin regulation of neuroendocrine systems.Front Neuroendocrinol2000; 21(3): 263-307

4 Ishikawa T, Fujioka H, Ishimura T,et al. Expression of Leptin and Leptin receptor in the testis of fertile and infertile patients.Andrologia2007; 39 (1): 22-27

5 Soyupek S, Armagan A, Serel TA,et al. Leptin expression in the testicular tissue of fertile and infertile men.Arch Androl2005; 51(3): 239-246

6 Aquila S, Gentile M, Middea E,et al. Leptin secretion by human ejaculated spermatozoa.J Clin Endocrinol Metab2005; 90(8): 4753-4761

7 劉雅峰, 周燦權(quán), 歐建平, 等. 精液白細(xì)胞對精液主要參數(shù)及精子功能的影響分析. 中國優(yōu)生與遺傳雜志2008; 16(2): 105-106

8 饒利強(qiáng), 廖錦先, 葉向陽, 等. 精液白細(xì)胞與不育癥之間的關(guān)系研究. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2011; 8(35): 43-45

9 Osakh RA, Agarwal A, Kandlrall E,et a1. Leukocytospermia is associated with increased reactive oxygen species production by human spem.Fertil steril2002; 78(6): 1215-1224

10 高久春, 薛百功, 許宗革, 等. 精液白細(xì)胞與精子運(yùn)動參數(shù)關(guān)系的研究. 中國婦幼保健 2005; 20(18): 2305-2307 11 岳林. 精液中白細(xì)胞含量與男性不育的相關(guān)性研究. 中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志 2006; 16(1): 102-104

12 Tremellen K, Tunc O. Macrophage activity in semen is significantly correlated with sperm quality in infertile men.Int J Androl2010; 33(6): 823-831

13 Erenpreiss J, Hlevicka S, Zalkalns J,et al. Effect of leukocytospermiaon sperm DNA integrity: a negative effect in abnormal semen samples.J Androl2002; 23(5): 717-723

14 Quehenberger P, Exner M, Sunder-Plassmann R,et al.Leptin induces endothelin-1 in endothelial cells in vitro.Circ Res2002; 90(6): 711-718

15 Bouloumie A, Marumo T, Lafontan M,et a1. Leptin induces oxidative stress in human endothelial cells.FASEB J1999; 13(10): 1231-1238

16 Maingrette F, Renier G. Leptin increases lipoprotein lipase secretion by macrophages: involvement of oxidativestress and protein kinase C.Diabetes2003; 52(8): 2l2l-2128

（2013-11-08收稿）

Analysis of the efffect of Anti-inflammatory therapy on seminal Leptin, ROS, in leukocytospermia patients*

Zhang Tao, Chen Bin**, Lv Yiqing, Wang Hongxiang, Hu Kai, Jin Yan,
Yang Hao, Feng Tan, Zhu Hong, Huang Yanping, Han Yingfa, Wang Yixin, Huang Yiran
Department of Urology, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University; Shanghai Institute of Andrology, Shanghai 200001, China

Chen Bin, E-mail: dr_binchen@126.com

ObjectiveTo investigate the levels of seminal Leptin, ROS, as well as sperm parameters in leukocytospermia patients tretaed with anti-inf ammatory therapyand explore their correlation.MethodsTotal of 80 male infertility patients with leukocytospermia (WBC group) were enrolled in the study, and 40 normal sperm samples were taken as the control. The sperm parameters were detected by computer assisted sperm analysis (CASA). The levels of semen plasma Leptin and ROS were measured using RIA and TBA kits respectively.ResultsThe sperm concentration and viability in WBC group before treatment were lower than those of the control group (P<0.05,P<0.01), whereas, the levels of semen plasma Leptin and ROS were higher than those of the control group (P<0.05,P<0.01). The level of Leptin in semen plasma was positively correlated with the ROS level (r=0.695,P<0.05). After treatment, the increase of semen viability anddecrease of Leptin and ROS level were found in WBC group.ConclusionIncreased levels of seminal Leptin and ROS were founded in WBC group. Positive relationship between seminal Leptin and ROS indicated that Leptin might involve in oxidative stress and result in the decrease of sperm concentration and viability.

leukocytospermia; Leptin; reactive oxygen species

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.03.013

R 698.2

資助: 國家自然科學(xué)基金資助（課題編號：81270741）; 上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)重點(diǎn)學(xué)科群建設(shè)項(xiàng)目（PWZxkq2010-03）

**通訊作者, E-mail: dr_binchen@126.com