炙甘草湯、右歸飲刺激臍靜脈內皮細胞分泌TPO與EPO的比較研究

馬鵬 劉淵

（成都中醫藥大學，四川成都 610075）

炙甘草湯、右歸飲刺激臍靜脈內皮細胞分泌TPO與EPO的比較研究

馬鵬 劉淵

（成都中醫藥大學，四川成都 610075）

目的：比較研究炙甘草湯、右歸飲對臍靜脈內皮細胞分泌TPO與EPO的影響。方法：臍靜脈內皮細胞設空白對照組、炙甘草湯組、右歸飲組及混合組，每組分別加入相應的中藥液，于培養第3、6、9天收集細胞培養上清，ELISA方法檢測細胞培養上清中TPO與EPO的分泌水平。結果：（1）TPO分泌方面，第6天，與空白對照組比較，炙甘草湯明顯刺激臍靜脈內皮細胞產生TPO；第9天，炙甘草湯單獨作用以及兩種中藥聯合使用時TPO的產生與空白對照組相比也有明顯差異。（2）EPO分泌方面，第6天與第9天，右歸飲作用時能夠刺激臍靜脈內皮細胞產生EPO，但炙甘草湯單獨作用以及兩種中藥聯合使用時卻不能明顯刺激細胞產生EPO。結論：在刺激細胞產生TPO方面，炙甘草湯的效果最明顯，而在刺激細胞產生EPO方面右歸飲表現出更好的效果，兩個方劑作用機制存在差異，且兩個方劑的刺激作用均存在持續性。

炙甘草湯 右歸飲 臍靜脈內皮細胞 TPO EPO 體外實驗

炙甘草湯作為治療“脈結代，心動悸”的主方，已沿用近兩千年，療效顯著，為廣大醫家所稱贊。本方為滋陰補血、通陽復脈之劑，是治療氣血陰陽虛損之常用方劑，臨床廣泛運用于冠心病、心律失常等心血管疾病，并在血液系統、腫瘤等方面有大量研究[1-2]。中醫認為“心主血脈”，心通過“化赤”等作用參與血的生成，清代名醫唐宗海把炙甘草湯作為心參與生血的代表方，臨床上也不乏通過中藥改善骨髓微循環加強血生成的報道[3]。右歸飲為張景岳所制，屬于陰陽互濟法的代表方劑，為“陰中之陽藥”。右歸飲在臨床有廣泛應用，如血證、火證、痰病等病證[4]。兩個方劑均屬陰陽互濟之方，但兩方又有所側重，雖均能參與生血，但其生血機制有無差異一直是研究者關心的問題。本研究以人臍靜脈內皮細胞為對象，選取造血因子TPO與EPO，在體外環境下比較兩方對臍靜脈內皮細胞產生的影響。

1 實驗材料

1.1 細胞株臍靜脈內皮細胞株EA.hy926購于中科院上海細胞庫。

1.2 主要藥物炙甘草湯由炙甘草、桂枝、人參、生地黃、麥門冬、麻仁、大棗、生姜、阿膠組成，方中各成分比例為12:9:6: 50∶10∶10∶10∶10∶5；右歸飲由熟地、山藥、山茱萸、枸杞、甘草、杜仲、肉桂、制附子組成，方中各成分比例為20∶10∶10∶10∶5∶10∶4∶5。

所有中藥均購自北京同仁堂。中藥煎煮后進行過濾除渣、高溫滅菌，每毫升藥液含生藥0.2g。

1.3 試劑DMEM培養基（GIBCO），FBS（GIBCO），谷氨酰胺（GIBCO），六孔培養板（Corning），0.25%Trypsin-EDTA（GIBCO），TPO ELISA試劑盒（CUSABIO），EPO ELISA試劑盒（CUSABIO）。

2 實驗方法

2.1 分組細胞分為空白對照組（只加基本培養基，不加中藥液）、右歸飲組、炙甘草湯組及混合組（添加炙甘草湯與右歸飲），每組樣本數為10。培養第3、6、9天收取細胞培養上清，1000g離心15min，分裝后-20℃保存。

2.2 TPO檢測實驗前將各試劑放至室溫平衡30min，計算樣品孔及標準品孔數，100μL/孔在相應孔中加入待測樣品及標準品，搖勻，封膜后于37℃孵育2h，吸棄孔內液體，每孔加入生物素標記抗體工作液100μL，37℃孵育1h，棄去孔內液體，洗板3次，每孔加入辣根過氧化物酶親和素標記工作液100μL，37℃孵育1h，洗板，加入顯色液，顯色終止后酶標儀讀取450nm處OD值。

2.3 EPO檢測實驗前將各試劑放至室溫平衡30min，計算樣品孔及標準品孔數，在相應孔中分別加入標準品50μL、檢測樣本50μL，每孔加入酶結合物50μL，封板，37℃溫育1h，棄去孔內液體，去離子水洗板3次，每孔加入顯色劑A液50μL、顯色劑B液50μL，振蕩混勻，37℃避光顯色15min，每孔加入終止液50μL，酶標儀讀取各孔450nm OD值。

3 實驗結果

3.1 炙甘草湯、右歸飲刺激臍靜脈內皮細胞分泌TPO實驗初期（第3天），所有實驗組上清中均未檢測到TPO的分泌；從第6天開始在所有實驗組中開始檢測到TPO的分泌，并且隨著時間的增加TPO分泌量增加，第9天培養上清中TPO檢測值為最高。統計學分析發現，在第6天，炙甘草湯組與空白對照組相比，TPO上升明顯，右歸飲組以及混合組與空白對照組相比無明顯差異；第9天，炙甘草湯組與空白對照組相比TPO含量差異明顯，同時混合組與空白對照組相比TPO表達也有明顯差異，但右歸飲組與空白對照組相比卻表現出降低趨勢。見表1。

表1 中藥對臍靜脈內皮細胞TPO表達水平的影響（±s）pg/mL

表1 中藥對臍靜脈內皮細胞TPO表達水平的影響（±s）pg/mL

注：“-”表示未檢測到。與空白對照組相比，**P＜0.005，***P＜0.0005。

組別樣本數第3天第6天第9天空白對照組10-28.7±1.597.9±0.8混合組10-34.5±2.1118.0±3.4**▲右歸飲組10-25.8±1.579.9±2.2**炙甘草湯組10-68.5±1.9***129.3±2.3***

3.2 炙甘草湯、右歸飲刺激臍靜脈內皮細胞分泌EPO實驗開始后第3天，所有實驗組均未檢測到EPO的分泌；第6天開始在右歸飲組檢測到EPO的分泌，但在空白對照組及另外兩個加藥組均未檢測到EPO分泌；第9天與第6天結果類似，僅在右歸飲組檢測到EPO分泌。見表2。

表2 中藥對臍靜脈內皮細胞EPO表達水平的影響±s）mIU/mL

表2 中藥對臍靜脈內皮細胞EPO表達水平的影響±s）mIU/mL

注：“-”表示未檢測到。

組別樣本數第3天第6天第9天空白對照組10---混合組10---右歸飲組10-1.476±0.0505.730±0.228炙甘草湯組10---

4 討論

促血小板生成素（thrombopoietin，TPO）是由332個氨基酸組成的多肽糖蛋白，是一種造血生長因子，目前認為它在體內的主要生理作用是刺激造血干細胞向巨核系祖細胞分化，并特異性地促進巨核系祖細胞增殖、分化，以及巨核細胞的成熟與釋放血小板。研究顯示，TPO單獨或與早期作用的造血生長因子協同可有效維持原始造血細胞的存活并保留其再植活性，同時促進早期祖細胞的擴增[5-6]。DeBruyn等[7]研究也發現TPO單獨使用可誘導CD34+細胞向CD41+細胞分化。這些研究均表明TPO在造血系統發育分化中具有重要作用。

促紅細胞生成素（Erythropoietin，EPO）是一種唾液酸糖蛋白，其分子含196個氨基酸殘基，成熟的EPO分子含166個氨基酸殘基。紅細胞的發育要經過干細胞、祖細胞、前體細胞、網織細胞等過程，其間必須要有相應的細胞因子作用細胞才能增殖、分化。促紅細胞生成素是紅細胞最重要的必不可少的細胞因子。它不僅可以刺激骨髓紅系祖細胞的增殖、轉化、成熟，使骨髓中網織紅細胞生成并釋放入血，而且可刺激血紅蛋白的合成最終導致外周血紅細胞數量的增加。EPO作為一種集落刺激因子已被人們廣泛接受和認識，自1985年EPO的cDNA被成功克隆后已成功應用于臨床治療血液系統疾病，可促進紅系祖細胞增生、分化和成熟。近年來發現EPO蛋白在胚胎、新生兒和成人腦脊液中均能檢測到，并隨年齡的增加而降低[8]。

本實驗通過炙甘草湯與右歸飲體外刺激臍靜脈內皮細胞的方法，探討其造血因子的分泌情況，分析兩種中藥在造血相關發育分化中的作用。實驗結果顯示，兩種中藥在體外刺激臍靜脈內皮細胞產生不同效應，炙甘草湯能夠明顯刺激臍靜脈內皮細胞產生TPO，右歸飲對臍靜脈內皮細胞刺激產生TPO的效果卻不明顯，相反TPO的分泌反而下降，表現出一定的抑制效應。在混合組中當兩種中藥同時作用時，炙甘草湯的刺激作用與右歸飲的抑制作用同時存在，炙甘草湯的刺激作用明顯強于右歸飲的抑制作用，最終刺激形成明顯高于對照組的TPO分泌。由此可見，炙甘草湯能夠明顯刺激臍靜脈內皮細胞分泌TPO。在刺激細胞產生EPO方面表現出相反的情況，炙甘草湯單獨作用以及兩種中藥聯合作用時效果均與空白對照相同，不能刺激細胞產生EPO，但右歸飲單獨作用時卻能刺激細胞產生EPO。綜合以上實驗結果可以發現，兩個中藥方劑因所含成分不同，作用機制存在差異，刺激產生細胞因子的效果表現不同，另外兩個方劑的治療作用均表現出一定的持續性，隨著時間增加刺激細胞因子的分泌也增多。

[1]李曉璇，郭偉星.炙甘草湯治療心血管疾病研究進展.山東中醫雜志，2013，32（2）：141

[2]鄧中甲.方劑學.北京：中國中醫藥出版社，2003：31

[3]白藍酈，劉莉，劉淵.炙甘草湯對心血管系統作用的研究進展.內蒙古中醫藥，2013（1）：126

[4]李克松.右歸飲抑制腦缺血糖皮質激素損傷海馬神經元的研究.廣東：廣州中醫藥大學，2008

[5]Kuter DJ，Beg1ey CG.Recombinant human thrombopoietin：basic bio1ogy and eva1uation of c1inica1 studies.B1ood，2002，100（10）：3457

[6]Luens KM，Travis MA，Chen BP，et a1.Thrombopoietin，kit 1igand，andf1k2/f1t3 1igand together induced increased numbers of primitive hematopoietic progenitors from human CD34+Thy-1+Lince11s with preserved abi1ity to engraft SCID-hu bone.B1ood，1998，91：1206

[7]DeBruyn C，De1f orge A，Martiat P，et a1.Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor ce11s：cord b1ood versus mobi1ized periphera1 b1ood.Stem Ce11s Dev，2005，14（4）：415

[8]Juu1 S E，Harcum J，Li Y，et a1.Erythropoietin is present in the cerebrospina1 f1uid of neonates.J Pediatr，1997，130：428

R285.5

A

1672-397X（2014）05-0073-02

馬鵬（1980-），男，碩士研究生，研究方向：歷代名醫治療難治性血液病的臨床思維及經驗研究。

劉淵，1iuy60s@sina.com

2014-01-28

編輯：吳寧

國家自然科學基金項目（81072728）