不同濃度苦參堿、大蒜素對人胃癌細(xì)胞株MKN-45殺傷作用的實(shí)驗(yàn)研究

佘玉清 陳昱倩 顏延鳳 鞠娟 李芳 韓康生

（南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇南京 210014）

不同濃度苦參堿、大蒜素對人胃癌細(xì)胞株MKN-45殺傷作用的實(shí)驗(yàn)研究

佘玉清 陳昱倩 顏延鳳 鞠娟 李芳 韓康生

（南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇南京 210014）

目的：觀察不同濃度苦參堿、大蒜素對人胃癌細(xì)胞株MKN-45體外生長的影響。方法：體外培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞株MKN-45，分別用不同濃度的苦參堿、大蒜素處理，采用CCK-8法檢測MKN-45細(xì)胞的生長情況。結(jié)果：不同濃度的苦參堿及大蒜素作用于MKN-45細(xì)胞后，對其增殖均表現(xiàn)出了明顯的抑制作用，并表現(xiàn)出濃度與作用時(shí)長的依賴性，最高抑制值分別達(dá)到了96.82%和93.44%。結(jié)論：苦參堿及大蒜素可以抑制胃癌MKN-45細(xì)胞的增殖，且與作用時(shí)間、劑量呈正相關(guān)。

苦參堿 大蒜素 胃癌MKN-45細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)研究

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率及死亡率較高，為胃癌治療尋找高效低毒的植物提取藥，已成為目前的研究熱點(diǎn)[1]。苦參堿是中藥材苦參、山豆根的主要活性成分，具有抗炎、抗纖維化、抗病毒等生物學(xué)活性。近年來，國內(nèi)外醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)苦參堿在抗癌方面具有明顯功效[2]。大蒜素具有抗菌、抗病毒、降血壓、降血脂等功能，對乳腺癌、皮膚癌、結(jié)腸癌等均有抑制作用。流行病學(xué)研究表明，長期大量食用大蒜素者胃癌的發(fā)病率、死亡率均明顯下降，大蒜的年攝入量與胃癌發(fā)病率成負(fù)相關(guān)[3]。此次我們通過體外實(shí)驗(yàn)研究不同濃度的大蒜素與苦參堿對人胃癌細(xì)胞株MKN-45的增殖是否具有明顯的抑制作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞與試劑人胃癌MKN-45細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存，購自上海生命科學(xué)院細(xì)胞所。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購自Inventrogen公司，胎牛血清購自杭州四季青試劑公司，CCK-8購自Sigma公司。大蒜素注射液購自山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司，苦參堿注射液購自廣州明興制藥廠。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)人胃癌MKN-45細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下，用含10%胎牛血清（加青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/mL）的DMEM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組實(shí)驗(yàn)分為苦參堿組、大蒜素組及陰性對照組。苦參堿終濃度分別為0.05、0.10、0.25、0.50、1.0mg/mL，大蒜素終濃度分別為5、15、25、30、40μg/mL。另設(shè)不加藥的陰性對照組，僅加入等體積的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液。

2.2 CCK-8法檢測兩種藥物對MKN-45胃癌細(xì)胞的增殖抑制作用取對數(shù)生長期MKN-45細(xì)胞，0.25%胰酶消化制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度1×105/mL接種于96孔板中，每孔90μL，空白孔加入90μL DMEM，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。后按一定質(zhì)量濃度梯度分別加入苦參堿、大蒜素，每孔100μL，陰性對照組加入等體積DMEM液，每個濃度3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)6、24、48、72h后，每孔加入CCK-8 10μL繼續(xù)培養(yǎng)4h，酶標(biāo)儀450nm波長下測定各孔吸光度A值，按下列公式計(jì)算抑制率：細(xì)胞增殖抑制率=[1－（A給藥組－A空白孔）／（A陰性對照組－A空白孔）]×100%。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，變量均采用（x±s）表示，兩樣本均數(shù)間的比較用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)間比較用單因素方差分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 苦參堿注射液對人胃癌MKN-45細(xì)胞增殖抑制率的影響見表1。當(dāng)苦參堿濃度為0.05mg/mL時(shí)，48h抑制率為5.73%，72h抑制率為6.43%。但當(dāng)濃度增加到1.0mg/mL時(shí)，48h抑制率為90.81%，72h抑制率更是達(dá)到了96.82%。這說明苦參堿注射液在濃度為0.05～1.0mg/mL范圍內(nèi)，隨著藥物濃度的增加和處理時(shí)間的延長，對MKN-45細(xì)胞的增殖抑制率逐漸增加，存在時(shí)間和劑量依賴性（P＜0.01），各個濃度的生長抑制率之間存在顯著性相關(guān)（ANOVA，P=0.000）。

表1 不同濃度苦參堿不同作用時(shí)間對胃癌細(xì)胞株MKN-45的增殖抑制率（x±s，n=9）%

3.2 大蒜素對MKN-45細(xì)胞增殖抑制率的影響見表2。隨著大蒜素濃度的增加和作用時(shí)間的延長，對MKN-45細(xì)胞的增殖抑制率逐漸增加，且各個濃度的生長抑制率之間存在顯著性相關(guān)（ANOVA，P=0.000）。在大蒜素濃度為5μg/mL時(shí)就出現(xiàn)了對人胃癌MKN-45細(xì)胞株的增殖抑制作用，48h與72h增殖抑制率分別為4.88%與5.91%；當(dāng)大蒜素濃度增加到40μg/mL時(shí)，48h與72h增殖抑制作用最強(qiáng)，分別為92.57%與93.44%。

4 討論

惡性腫瘤是中國人的第二大死因，而在我國因胃癌引發(fā)的死亡居惡性腫瘤死亡首位[4]。目前經(jīng)典的化療藥物因毒副作用較大和化療耐藥限制了其在臨床的應(yīng)用，傳統(tǒng)中藥逐漸成了目前較熱門的抗腫瘤研究方向。

近年來，體外實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)苦參堿可明顯地誘導(dǎo)骨肉瘤、人乳腺癌及肝癌細(xì)胞等的凋亡[5-7]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度的苦參堿均可以明顯抑制人胃癌MKN-45細(xì)胞的增殖，在一定的濃度范圍內(nèi)（0.05～1.0mg/mL），其對人胃癌MKN-45細(xì)胞的增殖抑制與時(shí)間和濃度呈正相關(guān)。其抗腫瘤的作用機(jī)制主要包括誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、分化、自噬以及細(xì)胞毒等多種作用[8-9]。林氏等[10]研究表明，苦參堿可明顯抑制黏附因子CD44、CD49的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，減輕內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，從而減少腫瘤的轉(zhuǎn)移。Dai等[11]發(fā)現(xiàn)苦參堿可抑制胃癌細(xì)胞系SGC-7901的增殖，并可使細(xì)胞的形態(tài)學(xué)發(fā)生變化，還可導(dǎo)致細(xì)胞的caspase-3含量明顯升高，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

大蒜素的抗癌作用在對照人群研究和臨床研究中已經(jīng)被證實(shí)，其作用機(jī)制主要有抑制致癌物的激活、抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞周期、對細(xì)胞骨架的破壞作用、抑制血管生成等[12]。大蒜素的主要成分為二烯丙基三硫，占40%以上。二烯丙基三硫?qū)ξ敢褐蟹蛛x出的硝酸鹽還原菌的生長及其產(chǎn)生亞硝酸鹽的能力均有明顯的抑制作用。已有大量動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，大蒜素具有預(yù)防胃癌發(fā)生的作用。本研究結(jié)果進(jìn)一步顯示了大蒜素在體外對人胃癌MKN-45細(xì)胞的增殖具有抑制作用，并且隨著大蒜素藥物的濃度和用藥時(shí)間的增加，其增殖抑制作用就更為明顯。研究表明，大蒜素可通過第二信號系統(tǒng)cAMP、PKC途徑，增強(qiáng)細(xì)胞凋亡始動基因fas及凋亡促進(jìn)基因box表達(dá)，抑制凋亡抑制基因bcl-2的表達(dá)，從而提高細(xì)胞凋亡率，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，并抑制其增殖活性，揭示了大蒜素誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制[3]。

綜上所述，苦參堿和大蒜素注射液在體外可直接抑制或殺傷人胃癌MKN-45細(xì)胞，具有較強(qiáng)的增殖抑制及殺傷能力，并且呈現(xiàn)與時(shí)間和濃度的正相關(guān)性。因此，這兩種藥物都是具有廣泛應(yīng)用前景的抗腫瘤藥物。

表2 不同濃度大蒜素不同作用時(shí)間對胃癌細(xì)胞株MKN-45的增殖抑制率（±s，n=9）%

表2 不同濃度大蒜素不同作用時(shí)間對胃癌細(xì)胞株MKN-45的增殖抑制率（±s，n=9）%

注：同一時(shí)間不同濃度與陰性對照組比較均P＜0.01；同一濃度不同時(shí)間比較均P=0.000。

0（陰性對照組）6h 5μg/mL2.83±1.734.71±0.894.88±0.685.91±1.33 15μg/mL6.92±2.978.91±1.8214.82±3.5717.93±5.37濃度24h48h 0 72h 0 0 0 25μg/mL11.83±2.8620.56±2.1125.28±4.4432.78±6.91 30μg/mL26.91±5.5739.91±5.1968.45±8.2461.95±4.90 40μg/mL39.96±4.8868.44±11.7492.57±9.9293.44±6.99

[1]朱艷琴，魯光華，徐玉芳.MTT法檢測體外培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞株MGC-803對苦參素注射液的藥物敏感性.中國藥理學(xué)通報(bào)，2006，22（10）：1278

[2]肖碩.苦參堿多種抗癌功效研究進(jìn)展.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2010，26（24）：4605

[3]李勇，劉冀，紅趙群.大蒜素對人胃腺癌BGC-823細(xì)胞影響的研究.中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志，2001，7（5）：307

[4]孫秀娣，牧人，周有尚.中國胃癌死亡率20年變化情況分析及其發(fā)展趨勢預(yù)測.中華腫瘤雜志，2004，26（1）：4

[5]周炳剛，孫靖中，蘇剛，等.苦參堿誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MCF27/ ADR的凋亡研究.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2003，20（6）：515

[6]鄭安祥，陳杰，陶惠民.苦參堿抑制人骨肉瘤MG-63細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的體外實(shí)驗(yàn)研究.實(shí)用腫瘤雜志，2005，20（6）：516

[7]張立明，鄭傳莉.苦參堿誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.西北藥學(xué)雜志，2006，22（3）：128

[8]Zhang S，Qi J，Sun L，et al.Matrine induces programmed cell death and regulates expression of relevant genes based on PCR array analysis in C6 glioma cells.Mol Biol Rep，2009，36（4）：791

[9]查勇，寸英麗，黃云超，等.苦參堿對肝癌細(xì)胞株SMMC-7221凋亡和自噬相關(guān)基因表達(dá)的影響.世界華人消化雜志，2010，18（29）：3078

[10]林洪生，李樹奇，裴迎霞，等.川芎嗪、苦參堿對癌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附及粘附因子表達(dá)的影響.中國新藥雜志，1999，8（6）：384

[11]Dai Z J，Gao J，Ji Z Z，et a1．Matrine induces apoptosis in gastriccarcinomacellsviaalterationofFas/FasLand activation of caspase-3．J Ethno-pharmacology，2009，123（1）：91

[12]蔣淑婉，李云，陳鶴.大蒜素的抗腫瘤作用及其機(jī)制研究進(jìn)展.醫(yī)學(xué)綜述，2013，19（8）：1420

編輯：吳寧

R735.2

A

1672-397X（2014）11-0082-02

佘玉清（1971-），女，醫(yī)學(xué)碩士，副主任中醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病。Susan710316@163. com

2014-06-18