養(yǎng)陰活血合劑對自發(fā)性高血壓大鼠的腎保護作用及其相關(guān)機制研究

周婷 屈長宏 蔣紅心 廖建春 茆俊卿 劉曉靜 黃萍

（揚州市中醫(yī)院，江蘇揚州 225002）

養(yǎng)陰活血合劑對自發(fā)性高血壓大鼠的腎保護作用及其相關(guān)機制研究

周婷 屈長宏 蔣紅心 廖建春 茆俊卿 劉曉靜 黃萍

（揚州市中醫(yī)院，江蘇揚州 225002）

目的：觀察中藥養(yǎng)陰活血合劑對自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）腎損害的保護作用及其可能機制。方法：將20只12周齡的雄性SHR大鼠隨機分為SHR組、中藥組、安博維組和聯(lián)合組，每組5只，同時設(shè)5只同齡Wistar-Kyoto（WKY）大鼠作為正常對照組。中藥組和安博維組分別予養(yǎng)陰活血合劑（等效劑量為每日15g/kg）和安博維（等效劑量為每日30mg/kg）灌胃，每日1次；聯(lián)合組則給予養(yǎng)陰活血合劑加安博維灌胃，每日1次；SHR組和正常對照組均給予等量的蒸餾水每日1次灌胃。共治療及喂養(yǎng)8周，監(jiān)測尾動脈血壓。在實驗開始給藥前及實驗結(jié)束后留取小便標本及血標本，檢測尿β2-微球蛋白（β2-MG）和尿微量白蛋白（mALB）及血尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）。采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測腎組織轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）mRNA和內(nèi)皮素1（ET-1）mRNA的表達。結(jié)果：實驗前SHR各組血壓均顯著高于WKY組；實驗后與實驗前相比，中藥組、安博維組和聯(lián)合組大鼠血壓均明顯下降。實驗后SHR組大鼠尿mALB、β2-MG較實驗前明顯升高，中藥組、安博維組則明顯下降，聯(lián)合組下降更明顯。實驗后中藥組、安博維組及聯(lián)合組大鼠尿mALB、β2-MG均明顯低于SHR組。與SHR組相比，中藥組、安博維組、聯(lián)合組腎組織TGF-β1和ET-1 mRNA的表達均顯著下降。結(jié)論：養(yǎng)陰活血合劑可降低SHR大鼠血壓，降低尿微量蛋白，其腎保護作用機制可能與其下調(diào)腎組織TGF-β1mRNA和ET-1mRNA表達的功能有關(guān)。

養(yǎng)陰活血合劑 自發(fā)性高血壓 轉(zhuǎn)化生長因子β1內(nèi)皮素-1 實驗研究

近年來，隨著高血壓的發(fā)病率逐漸增高，對于高血壓引起的腎損害越來越受到人們的重視。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)高血壓早期腎臟就已出現(xiàn)了異常改變，因此對于高血壓引起的腎損害的早期診斷和早期治療就顯得頗為重要。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)陰活血合劑對高血壓早期腎損害患者具有顯著的療效，本實驗進一步研究養(yǎng)陰活血合劑對自發(fā)性高血壓大鼠早期腎損害的保護作用及其相關(guān)機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）20只，Wistar-Kyoto（WKY）大鼠5只，SPF級，雄性，12周齡，平均體重（280±20）g，均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 藥物養(yǎng)陰活血合劑由熟地黃15g、山茱萸15g、何首烏15g、枸杞子15g、丹參15g、川芎10g、水蛭10g、川牛膝10g、澤蘭10g、天麻10g、鉤藤10g、丹皮10g組成，由揚州市中醫(yī)院制劑室煎制，煎制成濃度1.5g/mL的藥液。安博維（厄貝沙坦），150mg/片，杭州賽諾菲安萬民生制藥有限公司生產(chǎn)。

1.3 試劑與儀器Trizilo試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Fermentas公司）；PCR試劑和TaqDNA聚合酶（美國Fermentas公司）；瓊脂糖凝膠（英國OSOID公司）；DNA Marker（美國Fermentas公司）；10mg/mL溴化乙錠（美國Sigma公司）；美國ABI17900實時定量PCR儀；DSWY-1大鼠尾動脈血壓測量裝置（上海欣曼科教設(shè)備有限公司）；RM6240生物信號采集系統(tǒng)（成都儀器廠）；全自動生化分析儀（西班牙DIAGNOSTIC）；低速離心機（日立7060型，日本日立公司）；超低溫冰箱（SANYOMDF-U71V型，日本）。

2 實驗方法

2.1 分組與給藥25只大鼠予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，將20只SHR大鼠隨機分為SHR組、中藥組、安博維組和聯(lián)合組，每組5只，另取5只同齡WKY大鼠作為正常對照組。中藥組予以養(yǎng)陰活血合劑灌胃，每日1次，根據(jù)大鼠與人的體表面積比例，按人每公斤體重的臨床日用量折算大鼠的等效劑量，大鼠中藥等效劑量為15g/（kg·d）。安博維組給予安博維灌胃，每日1次，安博維的等效劑量為30mg/（kg·d）。聯(lián)合組則給予養(yǎng)陰活血合劑加安博維灌胃，每日1次。正常對照組和SHR組均給予等量蒸餾水每日1次灌胃。各組均治療并喂養(yǎng)8周。

2.2 血壓測量測量大鼠尾動脈血壓，實驗前測1次，實驗后第1、2周各測血壓1次，以后每隔2周測血壓并記錄，直至實驗結(jié)束。每記錄1次測血壓3次，取均值。

2.3 生化指標檢測在實驗開始給藥前及實驗結(jié)束前1天清晨留取小便標本，采用放射免疫法檢測尿β2-微球蛋白（β2-MG）和尿微量白蛋白（mALB）含量。在實驗前及實驗結(jié)束時留取血標本1mL，用以檢測血尿素氮（BUN）和肌酐（Scr）。

2.4檢測大鼠腎組織轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）mRNA和內(nèi)皮素1（ET-1）mRNA的表達采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse transcription-polymerase chainreaction，RT-PCR）技術(shù)進行檢測。斷頭處死大鼠后，迅速取腎臟，Trizol試劑提取總RNA，然后進行逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)。內(nèi)參照引物（Gapdh）上游引物：ACTTTGGCATCGTGGAAGGG，下游引物：ACTTGGCAGGTTTCTCCAGG；TGF-β1上游引物：AGGGCTACCATGCCAACTTC，下游引物：CCACGTAGTAG ACGATGGGC；ET-1上游引物：ATCAGAGCAACCAGACA CCG，下游引物：TGCACTTCCTTCTCAGCTCG。PCR反應(yīng)體系25μL，含2μL DNA模板，上游引物及下游引物（10μmol/μL）各1μL，12.5μL SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ，8.5μL滅菌蒸餾水。PCR反應(yīng)條件：95℃預變性30s；95℃5s、60℃30s，40個循環(huán)。每個循環(huán)延伸結(jié)束檢測熒光信號。隨后是一個緩慢升溫的程序，同時連續(xù)檢測DNA產(chǎn)物的溶解曲線，以了解樣品擴增的特異性，保障測定結(jié)果的準確可靠。然后用2-ΔΔCt法進行分析，相對表達量＝2-ΔΔCt。

2.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布計量數(shù)據(jù)以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Student-Newman-Keuls檢驗，P＜0.05示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠實驗前后尾動脈血壓比較實驗前SHR大鼠各組血壓差異無統(tǒng)計學意義，但均顯著高于正常對照組。實驗后與實驗前相比，中藥組大鼠血壓顯著下降（P＜0.05），安博維組和聯(lián)合組下降更顯著（P＜0.001），提示中藥養(yǎng)陰活血合劑有一定的降壓作用。見表1。

3.2 各組大鼠實驗前后腎功能比較實驗前后各組大鼠BUN、Scr含量比較均無明顯差異（P＞0.05）。實驗后SHR組mALB、β2-MG較實驗前明顯升高（P＜0.01），中藥組、安博維組則明顯下降（P＜0.05），聯(lián)合組下降更明顯（P＜0.01）；實驗后中藥組、安博維組及聯(lián)合組尿mALB、β2-MG明顯低于SHR組（P＜0.01）。見表2。

3.3 各組大鼠實驗后腎組織TGF-β1和ET-1 mRNA表達比較與SHR組相比，中藥組、安博維組、聯(lián)合組大鼠腎組織TGF-β1和ET-1 mRNA的表達均顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。見表3。

4 討論

高血壓病腎臟損害的病理表現(xiàn)主要為腎小動脈硬化，入球小動脈、小葉間動脈玻璃樣變性和間質(zhì)纖維化，其中腎間質(zhì)纖維化是高血壓病腎臟損害的重要病理基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）在腎間質(zhì)纖維化過程中起到重要的作用。TGF-β1可促進ECM蛋白的生成和沉積，降低蛋白酶的生成而減少基質(zhì)降解[1]，可促進腎小球系膜細胞和腎小管上皮細胞肥大；使腎小管上皮細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，成為肌成纖維細胞；促進細胞凋亡，導致腎小管萎縮、腎功能損害[2]。王甜等[3]研究發(fā)現(xiàn)，SHR大鼠腎臟組織TGF-β的表達隨周齡和血壓的增加而升高，與β2-MG的變化趨勢一致，可以作為早期腎損害的診斷指標。ET-1是參與了高血壓腎損害的另外一種重要的因子，是血管強力收縮劑，可顯著減少腎臟血流量（RBF）和腎小球濾過率（GFR）。ET-1還可促使腎臟血管平滑肌細胞的增生，腎小球系膜細胞生長，促進腎小球硬化的形成與發(fā)展，加重高血壓時腎功能損害的程度。有研究發(fā)現(xiàn)，16個月齡的自發(fā)性高血壓大鼠存在明顯的腎損害，血漿和腎組織中的ET含量也明顯升高，提示ET可能參與了SHR的腎損害[4]。

高血壓早期腎損害階段，腎臟沒有明顯的結(jié)構(gòu)和功能改變，缺少相關(guān)的臨床癥狀和體征，尿素氮和肌酐在早期不能反映腎小球的濾過功能，用常規(guī)的檢測方法難以較早判斷腎臟損害情況。而尿mALB在腎小球輕度受損時即明顯升高，標志著腎小球濾過膜電荷選擇性屏障損傷，是腎小球早期損害的敏感指標。β2-MG是體內(nèi)所有有核細胞的固有成分，幾乎全部由腎小球濾過，99%被腎小管重吸收，是判斷腎小管、腎間質(zhì)損害的敏感指標。尿mALB和β2-MG聯(lián)合檢測可以早期發(fā)現(xiàn)腎臟損害。本實驗證實，SHR大鼠在13周時即有尿mALB、和β2-MG的顯著升高，且隨著周齡的增加而升高（P＜0.01）。

中醫(yī)認為高血壓早期腎損害病位主要在肝腎兩臟，以肝腎陰虛、肝陽上亢為主要病理基礎(chǔ)，瘀血為主要病理因素。《內(nèi)經(jīng)·素問》云：“腎者主水，受五臟六腑之精而藏之”，“腎者，主蟄，封藏之本，精之處也”。腎虛，封藏失司，不能固澀精微，致精微外泄；肝腎陰虛，脈道失濡，血行不暢，腎絡(luò)瘀阻，且“久病必瘀”，瘀阻腎絡(luò)，清濁不分，精微壅而外溢，皆可出現(xiàn)尿mALB、β2-MG升高等高血壓早期腎損害的表現(xiàn)。據(jù)此理論，中醫(yī)治療立法以養(yǎng)陰活血為主，方中熟地黃、山茱萸、何首烏、枸杞子補肝腎，益精血，固澀精微；丹參、水蛭、川芎、丹皮、川牛膝活血化瘀通絡(luò)，川牛膝又引藥下行，丹皮兼清肝熱；天麻、鉤藤平息肝陽；澤蘭活血利水。全方共奏養(yǎng)陰活血、固攝精微之功效。前期研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)陰活血合劑可顯著降低高血壓合并早期腎損害患者的尿mALB、β2-MG和24h尿蛋白[5-6]。本研究通過養(yǎng)陰活血合劑治療自發(fā)性高血壓大鼠的實驗發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)陰活血合劑能降低SHR大鼠的血壓，顯著降低尿mALB和尿β2-MG，具有保護高血壓腎臟損害的作用，安博維與養(yǎng)陰活血合劑合用則有協(xié)同作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)陰活血合劑和安博維都可顯著抑制SHR大鼠腎臟組織TGF-β1和ET-1 mRNA的表達，兩者合用則作用更明顯，顯示養(yǎng)陰活血合劑可通過抑制腎組織TGF-β1和ET-1 mRNA的表達，進而抑制高血壓引起的腎間質(zhì)纖維化、腎小球硬化，從而起到腎保護的作用。

表1 各組大鼠實驗前后尾動脈血壓比較（±s）mmHg

表1 各組大鼠實驗前后尾動脈血壓比較（±s）mmHg

注：與本組0周時比較，△P＜0.05，△△△P＜0.001；與同時期SHR組比較，▲P＜0.05，▲▲▲P＜0.001。

組別動物數(shù)（只）0周8周正常對照組5108.6±8.050110.6±7.335 5177.2±11.17中藥組5177.0±8.436154.4±6.044△▲安博維組5177.5±9.678118.0±11.76△△△▲▲▲聯(lián)合組5174.8±8.402106.0±6.356△△△▲▲▲SHR組171.2±2.588

表2 各組大鼠實驗前后尿微量白蛋白、β2微球蛋白、尿素氮及肌酐比較（±s）

表2 各組大鼠實驗前后尿微量白蛋白、β2微球蛋白、尿素氮及肌酐比較（±s）

注：與本組實驗前比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與同時期SHR組比較，##P＜0.01。

組別動物數(shù)（只）正常對照組5 BUN（mmol/L）實驗前實驗后實驗前6.2±1.5 6.5±2.852.6±8.1 68.2±7.1**54.8±7.386.4±5.9**中藥組56.4±1.7 7.6±3.155.8±3.6 59.0±7.536.9±4.628.5±5.7*##56.1±6.243.2±9.3*##安博維組57.2±1.1 7.0±2.560.3±5.7 62.5±5.340.1±3.527.3±8.0*##52.7±5.839.5±8.7*##聯(lián)合組56.7±2.6 7.4±1.658.9±7.2 63.8±6.139.5±4.315.4±5.6**##56.8±8.129.3±6.4**##實驗前12.4±3.2 β2-MG（μg/L）實驗前實驗后5.9±2.46.3±3.1 6.8±3.0 8.5±2.453.5±5.4 67.2±2.138.7±5.2 Scr（μmol/L）實驗后58.5±9.4 mALB（mg/L）實驗后15.1±2.6 SHR組5

表3 各組TGF-β1和ET-1mRNA表達的變化（2-ΔΔCt）

[1]Schnaper H，Hayashida T，Hubchak SC，et al.TGF-beta signal transduction and mesangial cell fibrogenesis.Am JPhysiol Renal Physiol，2003，283（2）：243

[2]Li JH，Huang XR，Zhu HJ，et al.Role of TGF-beta signaling in extracellular matrix productionnunder high glucose conditions. Kidney Int，2003，63（6）：2010

[3]王甜，李靜，時曄，等.轉(zhuǎn)化生長因子β與結(jié)締組織生長因子在自發(fā)性高血壓大鼠腎臟的增齡性變化.陜西醫(yī)學雜志，2012，41（8）：952

[4]王小丹，鄭秋甫，谷慶陽，等.堿性成纖維細胞生長因子和內(nèi)皮素在自發(fā)性高血壓大鼠腎損害中的作用.解放軍醫(yī)學雜志，2000，25（4）：270

[5]周婷.中西藥合用治療高血壓病早期腎損害療效研究.遼寧中醫(yī)雜志，2008，35（2）：256

[6]周婷，屈長宏.養(yǎng)陰活血方聯(lián)合安博維治療高血壓病早期腎損害患者30例.中醫(yī)雜志，2009，50（11）：1009

R544.105

A

1672-397X（2014）11-0077-03

周婷（1963-），女，本科學歷，主任中醫(yī)師，主要從事腎臟疾病的中西醫(yī)結(jié)合診治研究。Yzzt11757@163.com

2014-05-26

編輯：吳寧

江蘇省中醫(yī)藥局科技項目（LZ11168）