紫山藥組織培養及褐化因素的研究

王碧琴，朱 祺，劉騰云，李彥強，周 華

(江西省科學院生物資源研究所，江西 南昌330029)

0 前言

紫山藥(Purple yam)，別名薯蕷，屬薯蕷科(Dioscoreaceae)山藥屬(Dioscorea L.)，是一年生或多年生纏繞性藤本植物，能形成肥大的地下肉質塊莖供為食用或藥用。我國是山藥重要原產地和馴化中心，紫山藥屬于山藥的紫紅肉品種群，在我國南方的浙江、福建、江西等地有大面積栽培。

紫山藥通常以塊莖切成6～10 cm長帶隱芽表皮的塊莖(約80 g)，可直接栽種或育苗移栽。由于長期的塊莖繁殖和耕地的連作，植株遭受到病毒病侵染，以致種性退化，品質下降，產量降低，感病株率上升。隨著農藥化肥的大量施用，病毒病不但得不到控制，而且更加嚴重至蔓延，危及到整個產業以致某些優良品種瀕臨滅絕。

紫山藥通過莖尖脫毒培養不但能去除植株體內的病毒或減少病毒，而且能使優良品種種性得以保存延續［1，2］。但山藥在組織培養過程中存在著嚴重的褐化發應，經常發現山藥組培苗或外植體枯死及其基部培養基顏色黑褐化，這種褐化現象又稱為酚污染，嚴重影響外植體的脫分化和培養物的再分化［3］。到目前為止，山藥(紫山藥)組織培養研究僅限于少量的實驗室階段，還末涉及到快繁體系方面的研究。因此，本著紫山藥組織培養快繁體系的建立，生產組培試管苗，盡快轉化應用田間，筆者就目前紫山藥組織培養過程中的褐化現象及有效控制等方面進行了研究探討。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紫山藥(紫玉紅)嫩莖尖、莖段。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基 初始誘導分化培養基:MS6BA 0.5～2.0 mg/L+NAA 0.1～0.5 mg/L或培養基附加Vc、PVP、AC 0.01～0.2 g/L，以上培養基含45 g/L食用糖，瓊脂6 g/L，pH5.8。

1.2.2 外植體消毒和接種 莖段和莖尖消毒:去掉展開的葉片分別剪成帶葉柄的莖段、莖尖，用洗液清洗.分別用0.1%Hgcl浸泡消毒。莖尖5 min，莖段10 min然后用無菌水沖洗數次。消毒好的材料備用。

(1)莖尖和莖段的初始培養:莖段0.8～1.0 cm，莖尖0.5～0.8 cm分別接種于初始培養基上每處理重復3次，培養30 d后統計成活率(成活率=枯死數/接種數×100%)。

(2)激素濃度對莖尖、莖段的誘導分化:莖段0.5 cm，莖尖0.3 cm左右接種在誘導分化培養基上每處理重復2次。40 d后觀察變化，統計誘導分化率及不定芽增殖數(誘導分化率=萌芽數/接種數×100%，不定芽增殖數=培養物萌發新的芽體數)。

(3)培養周期對莖尖、莖段誘導分化:莖尖0.3 cm，莖段0.5 cm分別接種在誘導分化培養基上，每處理重復2次，培養20 d為繼代周期，繼代4次并統計不定芽增殖數。

(4)抗褐化劑Vc、PVP、AC篩選及對莖尖、莖段誘導分化影響:培養一個周期，觀察培養物生長狀況和培養基褐化的程度。比較不同抗氧化的效果及組培苗生長狀況。

以上培養溫度25±2℃，光照1 200 lx，10 h/d。

2 結果與分析

2.1 莖尖、莖段的誘導培養

莖段帶節間0.8～1.0 cm(72段)，莖尖0.5～0.8 cm(30個)分別接種于初始培養基上培養，2－3 d培養物基部開始變褐，褐色物滲入培養基呈圓形并遂步擴散，10－15 d左右外植體基部褐化加重，部分莖尖變褐整個枯死，莖段基部1/3處枯死。培養20 d統計莖尖平均枯死率在17%，莖段枯死率在7%。外植體培養20 d后基部的莖節處腫大并有淡紅色圓形芽點;莖段葉柄張開腋芽開始萌動，30 d左右莖段葉腋抽生1～2個不定芽0.5～2.5 cm，稍嫩的莖段葉腋形成0.1～0.2 cm小瘤狀物，初始培養莖尖、莖段的成活率分別是43%和91%。

2.2 6-BA濃度對莖尖、莖段的誘導分化影響

莖尖0.3 cm(12個)、莖段0.5 cm(30段)分別接種在1、2、3、4、5誘導分化培養基上，培養3－5 d莖段切口處分泌褐色物擴散培養基由淺褐致深褐，10－15 d莖段基部增粗葉柄張開，腋芽萌發單個或多個不定芽小點，單個不定芽伸長生長較快，20 d左右不定芽基部生長1～3條淡紅色不定根，不定根生長伸長較莖快，直接伸入培養基，分泌酚類化合物受多酚氧化酶激活產生醌類物質，加重了培養基褐化程度，15－20 d不定根2～4 cm長，不定芽2.0 cm長，隨著激素濃度的加大莖段形成的叢生芽體數增多，最多可達5～7個不等。莖尖由于個體小分化的芽點也小，雖然分化率高但能形成正常的小芽少，隨著培養時間延長部分小芽可生長成正常芽，但芽體較弱、矮小或畸型。實驗表明6-BA 1.0 mg/L下有利培養不定芽。

2.3 培養周期對莖尖、莖段誘導分化影響

莖尖0.3 cm(30個)莖段0.5 cm(30個)接種誘導分化培養基上，每培養20 d后繼代相同培養基并統計增殖的小芽，莖段培養15－20 d后不定芽由莖段基部葉腋隱芽分化或由腋芽直接分化形成不定芽;此時莖尖僅在葉腋處膨大露出小小的芽點。2次繼代后莖段不定芽0.5～1.0 cm長，40 d不定芽增殖數達到高峰，增殖數由(20 d) 23＜(40 d)42＞(60 d)15＞(80 d)11遂步下降，隨著培養時間增加，不定芽增多，形成多個多芽體，莖節處有少量的不定根，莖段第3次繼代苖高為2.0～4.0 cm，基部1～2節處有多條不定根，并有多芽體叢生現象。此時基部不定芽的分化基本停止，但莖腋處仍產生重疊多芽體，致使芽體莖桿細小或叢枝狀，不利于作次代增殖材料。不定芽增殖數隨培養時間延長由少量增多至高峰后到回落，實驗表明，在一定的時間內莖尖、莖段培養增殖數(20 d)0＜(40 d)27＜(60 d)40＞(80 d) 34，培養60 d為不定芽增殖數最高值。

2.4 Vc、PVP、AC篩選及莖尖、莖段誘導分化影響

紫山藥外植體莖尖、莖段在誘導培養基中添加一定量的抗氧化劑Vc、PVP、AC時所產生的效果差異顯著。抗壞血酸(Vc)對莖尖、莖段外植體培養過程中沒有抑制褐化的效果，但對培養基凝固有負作用。莖尖在PVP、AC培養基培養隨著抗氧化劑量的增加，死亡率增加。這是因為在培養過程中培養物對培養條件有敏感拮抗效應，加上外植體接種后由自養變為異養，細胞代謝發生變化，產生了一些酚類化合物，這些酚類物質受多酚氧化酶激活，被氧化后產生醌類物質，醌類物質呈粽褐色隨著外植體的傷口或愈傷組織遂步從組織擴散到培養基中，影響了外植體器官的分化，以致幼芽體不能正常的機理代謝而死亡。PVP、AC對莖段培養有抗褐化能力，能抑制褐化物質進一步擴散，維持莖段幼芽體正常萌芽生長。這是因為莖段組織具有完備成熟的機理系統，在抗氧化物質的作用下對自生系統的調節，對物體基部的褐化－醌類物質受到阻隔，在一定的范圍內擴散，不影響莖段的正常生長。這種不同的效果與外植體自身的生理結構－植物受體部位內源物質的含量有密切關系。

PVP、AC對莖尖、莖段外植體培養過程中有抑制或延遲褐變的效果。

3 小結

褐變是指植物組織培養過程中，由于外植體組織被切割和接種快繁時，損傷切面細胞中酚類物質在酚氧化酶的作用下與氧氣聚合而發生氧化反應，形成有毒的醌類物質。外植體切面迅速變成棕褐色或暗褐色，并逐步擴散至培養基中，抑制其它酶的活性，導致組織代謝紊亂，生長受抑制，最終致使外植體死亡［4］。

(1)紫山藥細胞組織含有極高量的酚類物質，因此外植體在接種后需多次的更換培養基，減少褐化物的累積，保持培養物的正常生長環境。

(2)據資料“6－芐基腺嘌呤和激動素濃度高也有誘導褐化的作用”。培養基中的高激素濃度有加劇外植體褐變的因素，實驗表明，在莖段誘導分化培養基激素濃度越高褐化越重。由此，6-BA激素濃度在1.0 mg/L有利于器官的正常分化。

(3)試驗證明，在一定的范圍內激素濃度與莖尖、莖段誘導分化率成正比，激素濃度越高分化的不定芽越多，繼代次數越多產生不定芽多芽體也多，尤其在不定芽2次繼代后比較明顯，這與晏嬰才的盾葉薯蕷組織培養與快速繁殖研究激素組合對多芽體的影響結論基本相似。

［1］ 顏昌敬.植物組織培養手冊［M］.上海:上海科學技術出版社，1990.

［2］ 蔡建榮，曾 軍，張志勇，等.懷山藥莖段組織培養及增殖的研究［J］.福建農業科技，2002，(2):14－15.

［3］ Mager AM，Harel.Polyphenol Oxidases in plants［J］.Phytochemistry，1979，18:193－215.

［4］ 蔡建榮.山藥莖段愈傷組織褐變與外源藥物抑制效應的研究［J］.浙江農業科學，2008，(5):523－525.