凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)造血激素的組織分布及細胞定位分析*

徐萌霖 梁 艷 盧金鳳 王曉雯李 晨 邢 婧 黃 倢

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凡納濱對蝦()造血激素的組織分布及細胞定位分析*

徐萌霖1, 2梁 艷2盧金鳳2王曉雯1, 2李 晨2邢 婧1黃 倢2①

(1. 中國海洋大學海水養殖教育部重點實驗室 青島 266003; 2. 農業部海洋漁業資源可持續利用重點開放實驗室 中國水產科學院研究院黃海水產研究所 青島 266071)

造血激素(astakine)是一種具有促進造血組織細胞分化和增殖作用的甲殼動物細胞因子, 參與甲殼動物的造血活動, 對于只依賴于非特異性免疫的甲殼動物抗感染能力有重要的意義。本實驗室前期成功克隆凡納濱對蝦造血激素(LvAST)的基因Lvast。為了進一步了解其功能, 本文通過實時熒光定量PCR技術檢測了Lvast表達的組織分布, 同時還用Dlight標記抗LvAST抗體進行了LvAST在對蝦細胞和組織中的免疫熒光定位分析。熒光定量PCR測定結果說明, Lvast主要在肝胰腺、鰓和肌肉中大量表達, 而淋巴器官和血淋巴細胞中表達量較低; 免疫熒光結果顯示, LvAST可同時存在于血淋巴細胞內和血淋巴細胞膜表面, 不同的血淋巴細胞表面的LvAST分布呈現出明顯差異, 可能具有重要的血細胞分類意義。LvAST蛋白在肝胰腺、鰓、肌肉、淋巴器官等組織中均有分布, 并且肝胰腺組織中分布較多, 淋巴器官組織中分布較少。

凡納濱對蝦; 造血激素; 熒光定量PCR; 激光共聚焦顯微鏡; 熒光定位

蝦類等無脊椎動物沒有抗體和特異性免疫功能, 缺少脊椎動物獲得性免疫系統的適應性和記憶能力, 它們的免疫防御功能主要依賴于先天的非特異免疫機制(Lorenzon, 1999; Philippe, 1999)。雖然如此, 甲殼動物的先天免疫系統仍然是高度發展的, 其發揮免疫功能的細胞和體液依賴血液的循環作用散布于身體的多種組織, 其對外源侵染的反應非常高效而復雜(Smith, 1991)。當甲殼動物的機體受到體內外刺激后, 游離的血細胞數量會急劇下降(Lorenzon, 1999), 而新的血細胞的補充對于維持甲殼類動物生理機能的穩定十分關鍵(Johansson, 2000)。近年研究發現了一種類細胞因子的造血激素(Astakine, AST), 這是一種具有促進造血組織細胞分化和增殖的甲殼動物細胞因子(Lin, 2009, 2011; 梁高峰等, 2012), 這種造血激素極有可能在蝦的免疫防御反應中起到重要作用。

AST最早由Lin等在軟尾太平蝲蛄()中發現, 隨后斑節對蝦()造血激素和凡納濱對蝦()造血激素(LvAST)的cDNA序列也相繼被克隆出來(Hsiao, 2010; 梁高峰等, 2012)。LvAST的序列中包含一個脊椎動物前動力蛋白(Prokineticin, PK)功能域, PK是一類存在于脊椎動物中的分泌蛋白(Hsiao, 2010), 其在多種組織中均有分布。該蛋白在脊椎動物中具有促血管內皮細胞增生的作用, 在血管生成、創傷感應、晝夜節律控制等行為的調制等方面具有重要作用(Melchiorri, 2001; Ng, 2005; Matsumoto, 2006)。但是LvAST的N-端沒有PK蛋白中保守的AVITGA, 因此LvAST的功能可能與PK蛋白的功能有所差別(梁高峰, 2011)。S?derh?ll等(2005)和Watthanasurorot等(2011)證實AST參與到造血作用中并且對于調節無脊椎動物的晝夜節律有重要作用。另外本實驗室前期研究中表明, AST對于白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)有一定程度的抑制作用(梁高峰, 2011)1)。而Lin等(2009)通過多種實驗方法證明F1F0-ATP合酶β亞基是造血激素的一個受體。本實驗前期研究中也發現F1F0-ATP合酶β亞基具有和LvAST相同的組織和細胞分布。

目前對于AST的研究仍然很少, 本研究通過實時定量PCR和免疫熒光技術對凡納濱對蝦AST蛋白在細胞和組織上進行定位, 為進一步了解AST的生物學功能和豐富凡納濱對蝦基礎研究資料提供數據。

1 材料與方法

1.1 對蝦

凡納濱對蝦()活體于2011年4月購自青島南山市場, 體長8—10cm, 經PCR檢測無WSSV, 在實驗室暫養3d。

1.2 抗體及其熒光素標記

將本實驗室重組表達的LvAST(梁高峰, 2011)委托GenSript公司(美國)制備成兔抗LvAST多克隆抗體, 經過抗原抗體吸附法進行純化后經間接ELISA法測定其滴度為1∶3000。分別將100μL兔抗LvAST多抗和100μL 2.5g/mL BSA(Sigma公司)加入到50μg Dlight 649-NHS熒光素粉末(Themor, 美國)中; 同時, 分別將100μL兔陰性血清和100μL兔抗β-actin單克隆抗體(1∶500, Proteintech公司, 美國)加入到50μg Dlight 488-NHS熒光素(Themor, 美國), 各在室溫下連接1h后, 于4°C在PBS (8g/L NaCl 8g, 2.9g/L Na2HPO4·12H2O, 0.2g/L KCl, 0.2g/L KH2PO4, pH 7.4)中透析過夜, 除去未標記上的熒光素。

1.3 RNA提取及cDNA第一鏈的合成

從3尾凡納濱對蝦腹節血竇取血淋巴并混合, 同時分別取對蝦的鰓、肌肉、肝胰腺、淋巴器官組織, 加入1mL TRIzol試劑(Invitrogen, 美國), 按照試劑所附操作方法提取總RNA。對所得到的RNA分別用無RNase的DNase I (上海生工生物工程有限公司)消化, 以Oligo(dT)為反轉錄引物, 使用Trans Script First-Strand cDNA Synthesis Super Mix試劑盒(Transgen公司, 德國), 將RNA反轉錄成cDNA。

1.4 實時熒光定量PCR

以合成的cDNA為模板, 根據序列(GenBank: HM594944), 用Primer Premier 5.0設計特異性引物Lvast-F和Lvast-R(表1), 以β-actin作為內參基因, 使用Titan One Tube RT-PCR Kit試劑盒(Roche公司, 德國), 在Rotor Gene 3000熒光定量PCR儀(Corbett Research公司, 澳大利亞)上進行實時定量PCR測定。操作方法參照說明書, 25μL反應體系中含模板cDNA 1.0μL, 10μmol/L引物0.5μL, 2× qPCR Super Mix 12.5μL, DyII 0.5μL。反應條件為95°C預變性10 s; 45個循環的95°C變性15 s, 57°C退火10 s, 72°C延伸15 s; 72°C延伸10 min。使用Rotor-Gene6軟件進行結果分析。

表1 實驗中用到的引物及其序列

Tab.1 Primers used in the experiments

1.5 對蝦血淋巴細胞原代培養

取3尾凡納濱對蝦, 用75%酒精消毒體表, 用無菌注射器從對蝦腹節血竇抽取血淋巴(注射器內預先抽取等體積抗凝劑: 450mmol/L NaCl, 10mmol/L KCl, 10mmol/L EDTA, 10mmol/L HEPES, pH 7.45), 于100×離心10min, 收集細胞沉淀, 用2×L15培養基(含19%胎牛血清, 100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素)重懸, 混勻后加入24孔細胞培養板中, 28°C培養2h。

1.6 石蠟組織切片的制備

向活凡納濱對蝦的肝胰腺部位分多點注射1mL Davidson’s AFA固定液(Lightner, 1988), 取出肝胰腺、鰓、肌肉、淋巴器官組織, 分別放入10倍體積的固定液中固定8h, 按對蝦組織學手冊的方法制備石蠟切片, 每張載玻片放置4塊切片, 展片后進行后續熒光定位實驗。

1.7 LvAST在血淋巴細胞上定位

取出貼壁生長良好的血淋巴細胞, 倒去培養基, 2×PBS輕輕洗滌2次, 每次3min, 分成4個實驗組。其中實驗組A和B用無水乙醇處理3min以增加細胞膜通透性; 實驗組C、D血淋巴細胞不進行處理。2×PBS洗滌后用10% BSA(溶于PBS中)37°C封閉1h, 去除封閉液后, 在A和C組細胞中加入1∶1的Dylight 649標記的兔抗LvAST多抗和1∶1 Dylight 488標記的兔抗β-actin單抗, B和D組加入Dylight488標記的免疫前兔血清和Dylight 649標記的BSA作為陰性對照, 37°C避光孵育2h。2×PBS洗滌后, 用300nmol/L DAPI (溶于2×PBS中)復染3min, 用激光共聚焦顯微鏡(Nikon A1R, 日本)觀察。

1.8 LvAST在肝胰腺、肌肉、鰓、淋巴器官石蠟切片上的定位

取肝胰腺、鰓、肌肉、淋巴器官石蠟切片各一張, 按照對蝦組織學手冊的方法脫蠟后PBS洗2×5min; 放入100mL 10mmol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0), 用微波爐高火加熱至沸騰, 室溫下放置10min后再次加熱至沸騰, 待溫度降為室溫后PBS漂洗3×5min; 加10% BSA(溶于PBS中)室溫封閉1h, PBS漂洗3×5min; 切片用基因芯片圍欄(博奧生物有限公司, 北京)隔成A、B兩部分。在各切片圍欄A部分樣品上加入200μL 1∶1 Dylight 649標記的LvAST多克隆抗體, 各切片圍欄B部分加入等體積的Dylight 488標記的免疫前兔血清, 室溫孵育1h, PBS洗滌后, 加DAPI核染3min, 漂洗后50%甘油封片, 在激光共聚焦顯微鏡下(Nikon A1R, 日本)觀察。

1.9 激光共聚焦顯微觀察

分別以激發光488nm(觀察Dylight 488在518nm的綠色熒光)、425nm(觀察DAPI在461nm的藍色熒光)、654nm(觀察Dylight 649在673nm的紅色熒光)在激光共聚焦顯微鏡(Nikon A1R, 日本)下觀察并照相。觀察時采用20×物鏡, 應用NIS軟件進行圖像分析。

1.10 熒光顯微照片熒光強度的定量分析

應用激光共聚焦顯微鏡(Nikon A1R, 日本)自帶NIS軟件進行熒光強度定量分析, 記錄每張照片的激發光強度(Laser power, LP)和照相時的發射光增益(PMT Gain, PG): 利用軟件求出選定區域內所有顏色熒光的輪廓所覆蓋的面積(AF)和該區域內的紅色熒光強度(R), 則LvAST在單位重量的組織中的相對量(LvAST)按以下公式計算。

LvAST=R/ (AF·LP·PG)

2 結果

2.1 Lvast mRNA在各組織中的特異性表達

凡納濱對蝦鰓、肌肉、肝胰腺、淋巴器官、血淋巴5種組織經實時熒光定量PCR對和β-actin的mRNA進行分析, 檢測到這5種組織中均有mRNA 的表達。擴增產物熒光定量溶解曲線為單峰, 表明不存在非特異擴增及引物二聚體。根據Rotor-Gene 6軟件采用ΔΔCT方法對結果進行分析, 以肌肉組織作為校正樣品(Calibrator), 濃度定為1, 比較不同組織中在凡納濱對蝦組織中的表達(圖1)。結果表明mRNA在所檢測的鰓、肌肉、肝胰腺、淋巴器官、血淋巴中的表達差異很大, 其中肝胰腺、肌肉和鰓中表達量最高。

圖1 實時熒光RT-PCR對對蝦不同組織中Lvast mRNA表達的定量分析

注: 縱坐標的相對表達量為ΔΔCT相對定量分析(以β-actin為內參基因)

2.2 LvAST在血細胞上的免疫熒光定位

凡納濱對蝦血淋巴細胞用無水乙醇破壞細胞膜的通透性后(實驗組A), 與綠色熒光素(Dylight 488)標記的抗β-actin抗體孵育, 在細胞內呈現出大量細胞骨架蛋白β-actin的陽性信號(綠色熒光)(圖2c), 同時經紅色熒光素Dylight 649標記的抗LvAST抗體染色后, 細胞內呈現大量帶狀或點狀的紅色熒光(圖2c), 這種紅色熒光幾乎在所有的細胞中均能看到, 不過不同細胞上的熒光強度有明顯差異; 未經無水乙醇處理的血淋巴細胞(實驗組B), 與熒光標記的抗β-actin抗體和抗LvAST抗體孵育后, 未觀察到β-actin的陽性信號, 但部分血淋巴細胞依然可以觀察到明顯的LvAST的紅色熒光, 而部分細胞幾乎沒有或只有很少的點狀分布的紅色熒光(圖2a); 免疫前血清孵育的陰性對照組未觀察到綠色和紅色熒光信號(圖2d)。上述結果表明LvAST可分布在血淋巴細胞內和細胞膜表面, 但在不同血淋巴細胞表面的分布似乎有明顯的差異。

2.3 LvAST的熒光免疫組織化學染色定位

采用免疫熒光組織化學染色的方法對LvAST進行定位。用紅色熒光素DyLight 649標記的抗LvAST多克隆抗體對對蝦肝胰腺、鰓、肌肉、淋巴器官的石蠟切片染色后, 經654nm外源性激發光激發, LvAST染色呈紅色熒光, 從圖3中可以看出LvAST在肝胰腺、肌肉、鰓、淋巴器官中均有分布(圖3a, 3c, 3e, 3g)。細胞核染色后呈藍色, 陰性對照(圖3b, 3d, 3f, 3h)無明顯熒光信號。

圖2 激光共聚焦顯微鏡下免疫熒光細胞染色

a: 未經乙醇處理的血淋巴細胞用抗LvAST熒光抗體和抗β-actin熒光抗體染色, b: 未經乙醇處理的血淋巴細胞經熒光標記BSA和陰性血清染色的陰性對照, c: 乙醇處理的血淋巴細胞用抗LvAST熒光抗體和抗β-actin熒光抗體染色, d: 乙醇處理的血淋巴細胞用熒光標記的BSA和陰性血清染色的陰性對照

2.4 顯微照片熒光強度的相對定量分析

應用NIS軟件獲得視野中所有顯示紅色或藍色熒光的組織中的紅色熒光的平均熒光強度, 結合相應照片的增益和激發光強度, 求出單位面積組織中的紅色熒光強度即為LvAST在組織中的相對量(圖2)。結果顯示, LvAST在肝胰腺中分布最多, 在淋巴器官中分布最少, LvAST蛋白不同組織的分布結果與熒光定量PCR所得的mRNA在不同組織中特異性表達的結果相近, 但由于前者為蛋白水平后者為mRNA水平, 存在蛋白翻譯水平的調控, 因此存在少許差異。不經乙醇處理和經過乙醇處理的血淋巴細胞經熒光免疫染色后的熒光定量分析, 結果表明LvAST在血淋巴細胞表面的分布是LvAST在血淋巴細胞內及其表面總量的50%。

3 討論

WSSV是對蝦大規模死亡的主要病原, 具有高致死率和廣宿主嗜性, 自爆發以來對水產養殖業造成巨大損失。WSSV可感染對蝦甲殼下上皮組織、血淋巴細胞、結締組織、造血組織、鰓、肝胰腺管間血竇和淋巴器官細胞(雷志文等, 2002), 本實驗室前期通過養殖實驗分析LvAST對凡納濱對蝦抗WSSV感染的影響證明LvAST能在一定程度上提高對蝦抗WSSV感染的能力, 起到保護作用(梁高峰, 2011)。

圖3 激光共聚焦顯微鏡下LvAST的免疫熒光組織化學染色

a: 肝胰腺用抗LvAST熒光抗體染色, b: 肝胰腺經熒光標記的陰性血清染色的陰性對照, c: 肌肉用抗LvAST熒光抗體染色, d: 肌肉經熒光標記的陰性血清染色的陰性對照, e: 鰓用抗LvAST熒光抗體染色, f: 鰓經熒光標記的陰性血清染色的陰性對照, g: 淋巴器官用抗LvAST熒光抗體染色, h: 淋巴器官經熒光標記的陰性血清染色的陰性對照

圖4 凡納濱對蝦組織切片和培養細胞的熒光免疫化學檢測的熒光強度定量分析

A. 石蠟切片的熒光免疫化學檢測; B. 培養的血淋巴細胞經乙醇處理前后熒光免疫化學檢測

通過熒光定量PCR檢測, 本文揭示的mRNA主要在肝胰腺、肌肉和鰓中表達, 在淋巴器官和血淋巴細胞中的表達量很低, 這與Hsiao等(2010)的結果有所差異, 他認為造血激素主要分布在血淋巴細胞上, 而在肝胰腺中分布較少, 這種差異是否是與實驗所用的蝦的狀態、種類等因素有關, 還需要進一步證明。

本實驗首次通過免疫熒光細胞染色和免疫熒光組織化學染色的方法對LvAST在血淋巴細胞和肝胰腺上進行了LvAST蛋白的定位, 發現LvAST不僅在所有血淋巴細胞內存在, 而且也能分布在部分血淋巴細胞的表面, 并且根據劉勇等熒光強度的相對定量的計算方法, 在血淋巴細胞膜上的LvAST約為血淋巴細胞內及表明總量的50%; 而其組織分布特征顯示LvAST在凡納濱對蝦的肝胰腺、鰓、肌肉和淋巴器官中均存在, 在肝胰腺中分布最多, 其蛋白的分布特征與mRNA的表達特征基本相符, 但由于前者為蛋白水平后者為mRNA水平, 存在蛋白翻譯水平的調控, 因此存在少許差異。LvAST在血淋巴細胞表面分布呈現的細胞差異可能具有重要的血細胞分類意義。目前對這一方面還沒有相關報道, 我們將在接下來的實驗中進一步證明。

在LvAST的免疫熒光細胞定位觀察時, 為了更準確地證實LvAST是否在細胞膜上定位, 排除可能因為細胞不完整而帶來的干擾, 作者使用了綠色熒光標記的抗β-actin抗體作為細胞膜通透性的證明, 使實驗嚴謹地證明了LvAST的確在血淋巴細胞膜的外表面存在分布。本實驗采用DyLight染料標記抗體, 此染料的熒光強度較高, 光穩定性較好并且在很寬的pH范圍內都有很好的熒光信號, 并且此染料的水溶性保證偶聯反應中較高的染料-蛋白比例而不會引起染料的沉淀, 同時此染料的非滲透性保證了實驗的準確。

本文通過熒光免疫技術, 成功實現了LvAST在細胞和組織中的定位觀察, 首次證實LvAST幾乎在所有血淋巴細胞內及部分細胞膜外均有分布, 這一研究為下一步明確LvAST、ATP合酶和WSSV-VP37之間在細胞水平的相互作用研究提供了技術途徑。

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THE TISSUE DISTRIBUTION AND CELLULAR LOCALIZATION OF ASTAKINE IN SHRIMP

XU Meng-Lin1, 2, LIANG Yan2, LU Jin-Feng2, WANG Xiao-Wen1, 2, LI Chen2,XING Jing1, HUANG Jie2

(1. The Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, College of Fisherie, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Science, Qingdao 266071, China)

Astakine, a cytokine in crustaceans, involves in hematopoiesis for stimulating cell proliferation and differentiation, and plays a key role in crustacean immune responses. In our previous studies, the gene ofin shrimp(LvAST) was cloned and expressed. To get more information about the function of LvAST, its tissue distribution was quantified by real time RCR; and additionally, its cellular localization was observed by immunofluorescence method. Results reveald that thegene distributes widely in different tissues, with relative higher expression in hepatopancreas, muscle, and gills. The cellular location recognized by Dylight 649 labeled polyclonal antibody of LvAST showed that LvAST is expressed not only in hemocytes but also on some hemocytes. In histology immunofluorescence method, we observed that the LvAST protein distributed in hepatopancreas, gills, muscle, and lymphoid organ, which is in accordance with the result of its gene expression in shrimp tissues.

; astakine; immunofluorescence; location; laser-scanning confocal microscope

10.11693/hyhz20121206001

* 國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)項目課題, 2012CB114400號; 國家自然科學基金課題, 31101934號; 基本科研業務費專項經費, 20603022013009號; 中央級科研院所基本科研業務費資助, 2010-cb-06號。徐萌霖, 碩士研究生, E-mail: weihaichongzi@163.com

黃倢, 研究員, E-mail: huangjie@ysfri.ac.cn

2012-12-06,

2013-02-12

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