兩種鯊魚鰓部真菌菌群的PCR-DGGE分析*

張 翼 穆 軍 馮 妍 閻 松

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兩種鯊魚鰓部真菌菌群的PCR-DGGE分析*

張 翼1, 2穆 軍1, 3①馮 妍1閻 松1

(1. 大連交通大學環境與化學工程學院 大連 116028; 2. 大連理工大學生命科學與技術學院 大連 116024; 3. 浙江海洋學院海洋科學與技術學院 舟山 316022)

以提取自東海海域兩種鯊魚(尖吻鯖鯊和噬人鯊)鰓耙組織的總DNA為模板, 對其真菌菌群rDNA的基因內轉錄間隔區ITS1序列進行了PCR擴增, 擴增產物經變性梯度凝膠電泳(DGGE)分離, 電泳圖譜中的7條主要條帶經過二次PCR擴增后進行了克隆測序。NCBI-BLAST比對及分子系統發育分析結果表明, 尖吻鯖鯊鰓部真菌菌群的優勢種來自四個分類單元, 其中一個來自青霉屬, 三個來自曲霉屬; 噬人鯊鰓部真菌的優勢種來自四個分類單元, 其中一種來自青霉屬、兩個來自梗孢酵母屬、一個來自枝頂孢屬; 青霉屬為兩種鯊魚鰓部共同的優勢菌; 另外DGGE指紋圖譜顯示還有種類較豐富的劣勢菌存在。數據庫檢索顯示多數真菌分類單元具有較好的產生生物活性天然產物的潛力。該PCR-DGGE分析揭示鯊魚鰓部棲生有較豐富的真菌類群, 它們的代謝產物及其與宿主之間的相互作用還有待深入研究。

鯊魚; 鰓; 真菌菌群; ITS rDNA; 變性梯度凝膠電泳

在海洋動植物的體內或體表普遍棲生有真菌等各類微生物, 它們與宿主之間存在著共棲、共生或寄生關系。某些共附生微生物能產生一些具有細胞毒活性或抗菌活性的化學物質, 參與宿主對外界蟲害、捕食者、污損生物或病原微生物的化學防御, 提高宿主的環境適應性和生存能力(Haygood, 1999; Armstrong, 2001; Taylor, 2007), 因此成為海洋天然產物化學研究的焦點資源, 其中共附生真菌因其代謝潛力強大而備受關注(Bugni, 2004; Saleem, 2007)。但目前國內外海洋共附生真菌等藥源微生物的宿主來源主要集中于海綿、紅樹林、海藻等營固著生活的海洋動植物, 對于魚類等營游泳生活的宿主的相關研究報道非常少(林永成等, 2003; Bugni, 2004; 周榮麗等, 2008)。

鯊魚是體型較大的魚類, 廣泛分布于各大洋, 也是我國海域主要的軟骨魚類(朱元鼎等, 2001; 張清榕等, 2005)。它們的一些生理特點不同于硬骨魚類, 如沒有鰾, 而僅靠肝臟油脂浮力不足, 因此多數鯊魚一直在積極游泳靠鰭提供升力以避免下沉, 在游泳時大流量的海水流經鰓裂給鯊魚提供氧氣, 以姥鯊為例, 每小時須過濾2000m3的海水(孟慶聞等, 1987; Maddalena, 2007; Knickle, 2011), 這非常有利于截獲富集廣泛海域內的豐富多樣的海洋微生物。而且鰓組織充足的氧氣、毛細血管網提供的豐富營養都非常有利于真菌等好氧海洋微生物的棲居生長, 可視為一種“自航式微生物采樣器”, 但目前關于其藥源微生物的研究報道非常少(王燦等, 2009)。

眾所周知, 可培養微生物通常只占環境微生物總數的冰山一角, 而變性梯度凝膠電泳技術(DGGE)則可不依賴于傳統的菌株分離培養策略, 可直接揭示樣品中的微生物種類及其組成, 因此也被越來越多地用于研究珊瑚、海綿、海藻等海洋生物宿主中共附生微生物菌群組成(Bourne, 2005; Gao, 2008; Zuccaro, 2008)。由于鯊魚鰓具有較明顯的海洋微生物采集優勢, 而其共附生微生物菌群組成的研究尚為空白, 本實驗中運用PCR-DGGE技術分析了兩種鯊魚鰓部真菌菌群的組成, 以期對其生物多樣性提供一個全景視角, 為進一步的藥用真菌資源的開發及化學生態學的研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

兩種鯊魚鰓樣品于2010年4月取自浙江省樂清市一水產品加工廠剛運輸抵岸的東海海域漁獲的新鮮鯊魚, 使用無菌工具切割鰓耙樣品, 無菌海水沖洗后密封于無菌容器中, 于4°C保存并迅即空運至實驗室, 于超凈工作臺中用無菌海水沖洗后, 切割為小塊后置于25%無菌甘油凍存液中-70°C密封凍存。取樣時對鯊魚拍照并測量其身體尺寸, 經大連自然史博物館魚類學專家趙永波研究員鑒定分別為尖吻鯖鯊()(本實驗中編號為A)和噬人鯊() (本實驗中編號為B)。

1.2 樣品總DNA提取與純化

各取5 g每種鯊魚鰓樣品放入滅菌研缽中, 加入液氮研磨至粉末狀, 轉入50 mL離心管中。加入5 mL CTAB提取液(100 mmol/L Tris·Cl, 100 mmol/L EDTA-Na2, 200 mmol/L NaCl, 2% CTAB, pH 8.0), 37°C振蕩45 min。加入20% SDS至終濃度為2%, 65°C水浴2 h。然后用酚-氯仿法完成DNA的提取(Sambrook, 2002)。測定提取的總DNA濃度, 并用TE稀釋至100 ng/mL。而后使用上海生工UNIQ-10離心柱式膠回收試劑盒對模板DNA進行純化, 最終回收的DNA片段溶于40 μL TE緩沖液, 保存于-20°C備用。

1.3 PCR擴增

所用引物真菌ITS1-GC、ITS2-GC序列見表1, 反應條件參照Doare-Lebrun(2006)及Gao等(2008)的方法。反應體系為50mL總體積, ddH2O 40 μL, 10× Buffer (含2.0 mmol/L MgCl2) 5 μL, dNTP (10 mmol/L) 1mL, 正反引物各1mL (10mmol/L),酶(5 U/mL) 0.25mL, 模板DNA 2mL, 不足部分以ddH2O補齊。反應程序: 94°C 5min預變性; 94°C變性30 s, 54°C退火45 s, 72°C延伸1 min, 一共35個循環。最后延伸7 min。取PCR產物各2mL, 1.5%瓊脂糖凝膠加5% Goldview染液, 120 V穩壓電泳15 min, 檢查擴增效果。

1.4 變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析及條帶測序

采用美國Bio-Rad公司D-CodeTM基因突變檢測系統對A、B樣品進行DGGE分析(龍良鯤等, 2005; Gao, 2008)。所用的聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%, 變性劑濃度從15%—40% (100%的變性劑為7 mol/L尿素, 40%甲酰胺)。在70 V電壓下, 60°C電泳13 h。而后用超純水沖洗膠, 5% Goldview的染液染色30min, 凝膠成像拍攝圖譜。用潔凈的手術刀片切取代表性DGGE條帶, 按上海生工UNIQ-10柱式PAGE膠DNA回收試劑盒(SK1135)方法回收, 以回收的DNA片段為模板, 用引物對ITS1和ITS2(表1)對其進行第二次PCR擴增, 反應程序同1.3。擴增產物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳純化, 切膠后使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收DNA。使用T4 DNA連接酶將所得DNA片段連接到載體pUCm-T, 用生工SSCS快速一步法轉化感受態大腸桿菌(SK2301), 以藍白斑法挑選陽性克隆, 每個條帶取3個克隆, 培養過夜后使用SK1191 UNIQ-10柱式質粒小量抽提試劑盒提取質粒DNA, 并交上海生工生物工程公司使用通用引物M13+/-正反向測序。所得序列均提交Genbank, 其登錄號見表2。

1.5 序列比對及系統樹構建

用BLAST 軟件將測序結果與GenBank 中的相關序列進行同源性比較。并將序列結果及從Genbank中下載的相關種屬真菌的ITS1序列利用Clustal X 1.81軟件進行DNA 序列排列剪切, 使用MEGA 4.0軟件構建NJ樹、UPGMA樹(Thompson, 1997; Tamura, 2007)。結合BLAST比對及聚類分析系統樹結果, 確定優勢條帶所對應的分類單元。

表1 實驗所用真菌引物

Tab.1 Fungal primers used in this experiment

GC: CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCC

2 結果

2.1 PCR擴增

如圖1所示, 使用真菌rDNA通用引物對ITS1-GC、ITS2-GC從兩種鯊魚的鰓組織中都擴增出了較明亮的條帶, 其長度約為320 bp, 符合真菌ITS1 rDNA區的長度特征, 這表明這兩種鯊魚鰓部都棲息有較豐富的真菌。實驗中也曾使用通用引物對ITS1、ITS4試圖擴增出ITS1-5.8S-ITS2全長序列, 但發現擴增條帶亮度較為微弱, 不宜用于下一步的變性梯度凝膠電泳, 故未采用。

圖1 兩種鯊魚鰓部真菌ITS1 rDNA及鄰接區PCR擴增結果(A.尖吻鯖鯊; B.噬人鯊)

2.2 變性梯度凝膠電泳DGGE

將PCR擴增得到的產物(ITS1全長序列及相鄰的上游18S和下游5.8S的部分序列)經變性梯度凝膠電泳后, 可用于分析兩種鯊魚鰓中的真菌菌群。如圖2結果顯示, 兩種鯊魚鰓都顯示了較豐富的DGGE指紋, 樣品A、B各含有4條較亮帶, 這表明它們各自含有至少四種優勢菌, 其中帶1為兩樣品的共有條帶, 除此之外, 兩樣品中還都顯示了較豐富的微量條帶, 該結果表明這兩種鯊魚鰓部均棲息有較豐富的真菌類群。而這兩種鯊魚鰓中的優勢均又存在明顯差異, 這可能與其生活環境有關, 也可能是由種間差異或個體差異造成的。

圖2 兩種鯊魚鰓部真菌菌群的DGGE指紋圖譜(左: 紫外成像; 右: 自然光成像。A.尖吻鯖鯊; B.噬人鯊)

為提高擴增反應的可靠性、提高測序成功率, 利用引物對ITS1、ITS2對上述優勢條帶進行了第二次PCR擴增, 如圖3所示, 7條帶均獲得了較濃的擴增產物, 其序列長度符合真菌ITS1區特征。經電泳純化、連接載體、轉化大腸桿菌感受態細胞后, 從每個條帶獲得的3個陽性克隆提取質粒測序, 結果一致, 并將序列提交GenBank (表2), 通過BLAST與GenBank收錄的真菌相應序列數據比對后, 發現帶1為青霉屬(), 帶2、3為梗孢酵母屬(), 帶4為枝頂孢屬(), 帶5、6、7為曲霉屬(), 它們與數據庫中相應種屬菌株序列的相似性達到了99%—100%。

圖3 經第二次PCR擴增后的優勢條帶電泳圖

由于BLAST結果顯示每個條帶與GenBank收錄的相應屬中多個種的序列相似性數值均相同, 為進一步了解優勢條帶所代表真菌的分類地位, 從GenBank數據庫下載了相應屬中多個種的該段DNA序列進行比較, 這些序列均來自一些主要菌種庫, 如美國典型培養物保藏中心(ATCC)、美國農業部農業研究局菌種保藏中心(ARS/NRRL)、荷蘭微生物菌種保藏中心(CBS)、英國真菌保藏中心(CABI)及丹麥科技大學真菌保藏中心(IBT)的保藏菌株。利用MEGA4.0軟件將其與本實驗中條帶序列一起構建了系統樹(NJ法、UPGMA法)。結果顯示(NJ樹見圖4), 條帶1中的DNA序列與產黃青霉()、灰黃青霉()及袋鼠鼠青霉()的DNA序列具有較近親緣關系, 條帶5、6、7的DNA序列與聚多曲霉()和肉色曲霉()的DNA序列具有較近親緣關系, 條帶4的DNA序列與基利枝頂孢霉()的DNA序列具有較近親緣關系, 條帶2、3的DNA序列與嗜鹽梗孢酵母()的DNA序列關系較近。UPGMA樹也顯示相同親緣關系(未附圖)。

表2 DGGE優勢條帶序列BLAST比對結果

Tab.2 Sequences’ BLAST result of dominant DGGE bands

3 討論

眾所周知, 鯊魚被發現患惡性腫瘤的幾率非常低, 約為百萬分之一, 其同類之間因爭奪食物經常撕咬造成的外傷能很快愈合, 很少因此導致嚴重微生物感染, 這種海洋生物可能具有強大的化學防御機制(Lee, 1983; 賀麗虹等, 2005; Luer, 2012)。目前國內外對于鯊魚化學防御及藥用研究主要集中在鯊魚自身成分如角鯊烯、鯊魚肝及胃中的具有抗腫瘤和廣譜抗菌活性的角鯊胺Squalamine以及鯊魚軟骨抗腫瘤成分的研究與開發(Moore, 1993; Cho, 2002; 賀麗虹等, 2005)。

鯊魚是否存在其他化學防御機制, 如共附生微生物的協助防御呢？這是一個值得研究的問題。盡管迄今對于鯊魚共附生微生物研究報道還比較少, 但已有研究表明共附生微生物是有可能參與鯊魚的化學防御的。如鄭忠輝等(1998)曾報道從鯊魚的腸道中分離的一株弧菌和一株未鑒定菌株具有抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鰻弧菌的活性; 另外王燦等(2009)報道23株分離自姥鯊消化道的細菌中有65%具有抗菌活性; Luer(2012)報道從鯊魚的近親——兩種魟魚的體表粘液中分離到的共生細菌中分別有12.0%或21.6%的菌株可拮抗與外傷感染相關的病原菌。上述王燦等的報道中曾提及從姥鯊鰓中分離到5株分類地位及生物活性不詳的微生物, 但總而言之, 鯊魚鰓作為一個新穎的海洋共附生藥源微生物來源, 迄今國內外有關研究報道仍非常少。

本文研究表明, 在作者采樣的兩個鯊魚樣本鰓部的確生活有組成較豐富的真菌菌群, 且兩者的優勢菌群存在明顯差異, 其中青霉屬是它們共同的優勢菌, 曲霉屬為尖吻鯖鯊鰓部獨有優勢菌, 枝頂孢屬和梗孢酵母屬則為噬人鯊鰓部獨有優勢菌。其中青霉屬、曲霉屬、枝頂孢屬隸屬于子囊菌亞門, 而梗孢酵母屬隸屬于擔子菌亞門。值得注意的是青霉屬、曲霉屬也是被報道最多的海洋真菌類群, 這被認為跟它們對于鹽度的較強適應能力有關(Bugni, 2004)。另外, 曲霉、青霉也是最重要的生物活性次生代謝產物產生菌, 檢索天然產物數據庫Dictionary of Natural products on DVD (Buckingham, 2011)顯示庫中源自海洋青霉的天然產物多達235個(所有已收錄青霉天然產物達1435個), 而源自海洋曲霉的多達244個(所有已收錄曲霉天然產物達1524個)。枝頂孢屬也是重要的天然產物來源, 來自整個自然界的枝頂孢屬天然產物已達200個, 而源自海洋枝頂孢屬的已達47個。梗孢酵母屬最早是從海洋中發現的一個屬(Fell, 1966), 但尚未見到有來自梗孢酵母屬的天然產物收錄。除上文所述優勢菌外, DGGE指紋圖譜顯示這兩種鯊魚鰓中還含有豐富的微量真菌類群, 對這些微量條帶區域的進一步PCR-DGGE分析有助于更多地了解鯊魚鰓中真菌菌群組成, 而這些分類學背景將有可能用于指導選擇性培養策略來富集培養盡可能多的可培養真菌, 或運用非培養依賴性的宏基因組技術來有針對性的克隆一些具有藥用潛力物種的藥源基因。

圖4 基于優勢真菌菌群ITS1及相鄰序列構建的NJ聚類分析樹(自展1000次驗證節點置信度)

鯊魚屬于較特殊實驗材料, 從活體鯊魚鰓部現場即時取樣具有一定危險性, 而死亡鯊魚不排除受到空氣中真菌的污染。不過, 由于鯊魚鰓裂外皮對鰓耙具有一定封閉作用, 且本文鰓樣品采自死亡時間不足一天且剛運抵港口的新鮮鯊魚, 樣品經過無菌水重復沖洗, 可能存在的附著不牢的少量陸源污染真菌被較大程度上排除, 經鑒定的DNA條帶確屬報道較多的海洋真菌類群, 且與GenBank中一些海洋來源菌株序列的相似性達到了99%—100%。此外, 大量獲取新鮮鯊魚樣本也具有一定困難, 限于實驗條件, 本文所采鯊魚樣本數量有限, 尚不足以說明這兩條不同種鯊魚鰓部真菌菌群的差異是來自于種間差別抑或個體差別。對于以上不足之處, 如條件具備, 仍以從大量活體鯊魚樣本現場即時取樣更為科學嚴謹。另外, 噬人鯊和尖吻鯖鯊均廣布于熱帶、亞熱帶和溫帶海洋, 活動范圍廣、行蹤難溯, 關于其鰓部真菌菌群的差異與其生活環境的關系尚難做出推論。

PCR-DGGE作為一種可不依賴于菌株分離培養的技術, 對于海洋生物宿主中共附生微生物菌群組成的研究具有獨特的優勢。當然, 該技術也存在一定局限性, 如Vallaeys等(1997)報道過DGGE實驗中具有不同序列DNA片段的共遷移現象, 因此為了得到可靠結果, 本文中對于DGGE條帶采用克隆測序是確有必要的。另外動物宿主組織DNA樣品成分較為復雜, 干擾因素多, 這可能也導致了本文中共附生真菌ITS1-5.8S-ITS2 rDNA長序列擴增產物濃度過稀, 不足以進行DGGE及切膠分離, 從而未能獲得更長序列信息, 以進一步鑒定同一屬中的不同種。該技術有必要與其他分子生物學、微生物學方法配合使用, 以提供共附生微生物菌群組成更豐富的信息。

綜上所述, 對具有藥用潛力的鯊魚鰓部共附生真菌進行深入研究, 將有望發現新穎的活性化合物, 用于治療人類惡性腫瘤、病原微生物感染的新藥的開發, 另外也有助于進一步揭示鯊魚的化學防御機制, 對環境友好的海水養殖抗菌、抗寄生蟲病害藥物的開發也有借鑒啟示作用。

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THE PCR-DGGE ANALYSIS OF FUNGAL COMMUNITY IN THE GILLS OF TWO SHARK SPECIES

ZHANG Yi1, 2, MU Jun1, 3, FENG Yan1, YAN Song1

(1. School of Environmental and Chemical Engineering, Dalian Jiaotong University, Dalian 116028, China; 2. School of Life Science and Biotechnology, Daian University of Technology, Dalian 116024, China; 3. Marine Science and Technology College, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China)

Gill tissue DNA samples were extracted from two shark specimens from East China Sea,and, and used as templates for PCR amplification for the sequences of internal transcribed spacer 1 in ribosomal DNA gene of the fungal communities in the gill tissue. The PCR products were subsequently separated by DGGE (denatured gradient gel electrophoresis). Then, seven main electrophoresis stripes in the spectrum were amplified by secondary PCR, cloned, and sequenced. NCBI-BLAST comparison and molecular phylogenetic analysis indicated that the dominant fungal species in the gills ofcome from four taxonomical units including one from genusand three from. For, one dominant taxonomical unit comes from, two fromand one from A.is the common dominant fungal group in gills of the two shark species. In addition, the DGGE fingerprint also shows the presence of diverse minor fungal groups. Database searching suggested that most of these fungal taxonomical units have good potential in the production of natural bioactive substances. The PCR-DGGE analysis revealed that rich fungal community inhabits the two shark specimens’ gills. More investigations are demanded for understanding the metabolites and interaction with their hosts.

sharks; gills; fungal community; internal transcribed spacer ribosomal DNA; denatured gradient gel electrophoresis

10.11693/hyhz20121205002

* 國家自然科學基金項目, 20902009號; 中國博士后科學基金項目, 2011M500051號, 2012T50258號; 遼寧省教育廳優秀人才支持計劃, 2009R08號。張翼, 博士, 副教授, E-mail: hubeizhangyi@163.com

穆軍, 博士, 教授, E-mail: mujun1971@126.com

2012-12-05,

2013-04-22

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