青蛤(Cyclina sinensis)組織蛋白酶L基因的表達與重組蛋白活性分析*

劉詩萌 趙 婷 張 皞 潘寶平

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青蛤()組織蛋白酶L基因的表達與重組蛋白活性分析*

劉詩萌 趙 婷 張 皞 潘寶平①

(天津師范大學生命科學學院 天津市動植物抗性重點實驗室 天津 300387)

利用熒光定量PCR方法檢測了青蛤()在鰻弧菌()脅迫下組織蛋白酶L基因(CsCPL)在各組織的表達差別及其在血淋巴中的時序表達關系。結果表明, CsCPL基因在青蛤血淋巴、肝臟、外套膜、鰓和閉殼肌等組織中普遍表達, 其中以血淋巴表達水平最高。在鰻弧菌刺激后3—96h青蛤的血淋巴中CsCPL的表達量均出現明顯上調, 其中6h達到最大值并且與對照組有極其顯著性差異(<0.01), 說明該基因在青蛤免疫反應中具有重要作用。文章還對CsCPL基因進行了原核表達, 其產物蛋白分子量約35kDa, 經純化及復性后具有明顯的抑菌作用。

青蛤; 組織蛋白酶L; 實時定量PCR; 抑菌實驗

青蛤()是我國重要的海產經濟貝類(顧潤潤等, 2006)。近年來隨著國內青蛤增養殖規模的擴大和養殖密度的增加, 加之養殖環境的不斷惡化, 青蛤由病原微生物引起的疾病時有發生(孫國銘等, 2004; 曹華, 2004), 對該項養殖產業威脅很大。因此, 對該物種的免疫抗病機制研究具有重要的理論和實踐意義。

貝類的免疫反應系統包括細胞免疫和體液免疫, 其血細胞作為抵御外來微生物侵襲的主要承擔者, 其免疫應答功能主要通過血細胞內溶酶體中的多種水解酶進行(張朝霞等, 2006)。組織蛋白酶類是重要的溶酶體型半胱氨酸蛋白酶, 即通常所稱的溶酶體型蛋白水解酶類(Kirschke, 1987), 在各種類群生物體中均有發現(Lecaille, 2002), 且種類眾多, 從組織蛋白酶A到Z都有報道(Chwieralski, 2006)。根據催化作用機制, 大部分的組織蛋白酶歸屬于蛋白酶家族中的半胱氨酸蛋白酶, 有少數的組織蛋白酶屬于天冬氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶(楊東輝等, 2012)。

組織蛋白酶L是半胱氨酸蛋白酶中木瓜蛋白酶C1家族的主要成員, 以酶原的形式貯存于溶酶體中, 廣泛存在于各種動植物、微生物有機體中(Zeng, 2005; Liu, 2006), 在很多種類的蛋白質水解過程中起著非常重要的作用。研究表明組織蛋白酶L還參與許多重要的生理、生命活動, 如抗原呈遞、組織再生、骨質吸收、腫瘤入侵和轉移、炎癥發生和細胞凋亡等, 成為近年來備受關注的一類靶標蛋白酶。現已有研究人員從多種魚體中分離得到組織蛋白酶L, 對其性質研究也比較詳細(Yamashita, 1990; Lee, 1993; Aranishi, 1997; Visessanguan, 2003)。根據已見水產動物的組織蛋白酶L基因相關報道, 組織蛋白酶L在眾多水產動物免疫系統中均發揮重要作用, 如凡納濱對蝦() (Zhao, 2007)、中國對蝦()(Bu, 2008)、中華絨螯蟹()(Li, 2010)、脊尾白蝦()(段亞飛等, 2013)、紫貽貝()(Venier, 2006)、合浦珠母貝()(Ma, 2010)、三角帆蚌()(白志毅等, 2011)、海灣扇貝()(李娟等, 2011)。目前尚未見到青蛤該基因的研究報道。

1 材料與方法

1.1 材料

青蛤()樣品采于天津大港灘涂, 暫養于通氣海水中, 海水密度1.02—1.04g/cm3, 水溫21—24°C, 投喂5‰小球藻, 選擇沒有損傷, 形態上無顯著差異的個體[平均殼寬(19.12±0.57)mm, 平均殼長(29.14±1.23)mm, 平均殼高(29.52±1.47)mm], 一周后開始實驗。

將實驗室保存的鰻弧菌()菌種用2216E培養基于28°C下培養24h, 用無菌海水重懸菌液, 將其濃度調為OD600= 0.4。采用隨機分組方法, 每次試驗均設10個平行組。實驗組青蛤注射50mL/只的鰻弧菌菌液, 對照組注射等量的滅菌生理鹽水。注射前提取血淋巴、肝臟、外套膜、閉殼肌和鰓, 準確稱取組織質量50mg; 注射后3h、6h、9h、12h、24h、48h、96h時提取血淋巴。以上組織迅速放入液氮冷凍備用。

1.2 方法

1.2.1 cDNA文庫的構建 利用TRIZOL法, 提取青蛤各個組織的總RNA, 采用QIAGEN公司的Oligotex mRNA Kits方法進行分離純化。根據Clontech公司的SMART cDNA Library Construction Kit試劑盒說明書進行cDNA文庫的構建, 采用pBluescript II SK*改造體作為連接載體, 感受態細胞為(DH5a)。文庫隨機測序引物T7-F: 5′ TA-AT-ACGACTCACTATAGG 3′, T3-R: 5′ AATTAAC-CC-TC-ACTAAAGG 3′, 將所得序列去除載體序列后拼接得到contig及無法與其它序列拼接的singlest數據, 將測得的序列用BLAST進行同源性分析。

1.2.2 生物信息學分析 將獲得的青蛤mytimacin基因類似序列的全長cDNA序列與GenBank中的核酸數據庫作BLASTX分析, 利用開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)在線分析其蛋白質序列, 使用SignalP 3.0和SMART分別分析該基因的信號肽序列并查找結構域, ProtParam工具在線預測序列的分子式、分子量和等電點, 通過CLUSTALw進行氨基酸序列同源性分析。

1.2.3 CsCPL基因在青蛤各組織內的表達 利用TRIZOL法提取血淋巴、肝臟、外套膜、閉殼肌和鰓的總RNA, 反轉成cDNA在-20°C保存備用。以b- actin基因為內參基因, 實時定量引物分別為b-actin-F: 5′ CACCACAACTGCCGAGAG 3′,b-actin-R: 5′ CCG-A-T-AGTGATGACCTGACC 3′; CPL-F: 5′ GTCACA-TT-CGCCAAGCAA 3′, CPL-R: 5′ TGAAGGACCAGCA-AGAGCC 3′; 反應在Rotor-Gene 6000實時定量PCR儀上進行, 擴增體系為20mL, 反應程序為: 95°C預變性30s, 94°C變性5s, 60°C退火30s, 72°C延伸30s, 40個循環。

1.2.4 CsCPL基因在血淋巴內的時序性表達 利用TRIZOL法提取鰻弧菌侵染后各時間點血淋巴總RNA, 并反轉成cDNA。熒光定量PCR引物、反應體系及程序等見1.2.3。數據處理采用2-DDCt法(Livak, 2001), 使用SPSS軟件進行單因素方差分析。

1.2.5青蛤CsCPL的原核表達 用特異性引物CPL-N: 5′ CATATGCACCATCATCATCATCATTTG-C-C-T-GAGGAAATGGACTGGAGGA 3′; CPL-E: 5′ GAA-TTCTTAAACAAGTGGG TATGATGCCTGG 3′, 擴增得到的CsCPL成熟肽基因, 連接到pMD18-T載體, 得到pMD18-T-CPL并用pMD18-T載體通用引物和CsCPL特異性引物進行陽性克隆篩選, 測序鑒定。用RⅠ和Ⅰ雙酶切pMD18-T-CPL, 回收CsCPL基因并與RⅠ和Ⅰ酶切開環的pET30a(+)連接, 轉入表達宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)pLysS感受態細胞中, 得到重組質粒pET30a(+)-CPL并用T7引物和CsCPL特異性引物進行陽性克隆篩選及測序鑒定。

1.2.6 重組蛋白的純化復性與功能驗證 將轉化菌株接入到LB液體培養基中(含100mg/mL硫酸卡那霉素), 220r/min, 37°C培養至OD600左右, 取樣1mL作為誘導前對照, 向剩下的菌液中加入IPTG(終濃度1mg/mL)37°C誘導培養, 每隔1h取樣1次, 每次取1mL。取500mL誘導的菌液, 4°C, 6000r/min離心收集菌體, 以菌體裂解液重懸并超聲破碎。4°C, 6000r/min再次離心, 將沉淀重懸并過濾膜后得到重組蛋白粗提液。

將得到的重組蛋白粗提液過Ni柱純化, 使用康為世紀公司的Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒(包涵體蛋白), 將收集到的蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測。采用透析法進行復性, 將純化后的蛋白放在透析袋中, 再把透析袋放置在含有50mmol/L的Tris-HCl和8、6、5、4、2、1、0mol/L尿素緩沖液中(pH 5.5), 復性后的蛋白凍干, 稱重,-80°C保存備用。

將實驗室凍存的藤黃微球菌菌株37°C, 220r/min培養過夜, 6000r/min, 5min離心收集菌體, 用滅菌TBS溶液清洗三次, 用LB培養基重懸。將等濃度的重組蛋白CsCPL、牛血清白蛋白BSA、溶菌酶Lysozyme及滅菌TBS分別與菌體混合, 加入96孔板中培養, 編輯程序, 37°C震蕩培養, 每0.5h記錄一次OD600數據, 共計4.5h。將輸出數據于Excel中進行分析整理, 繪制菌生長曲線。

2 結果

2.1 青蛤CsCPL基因的結構

構建的SMART·cDNA文庫容量為1.12×106cfu/mL, 重組率約為96.4%。經隨機挑取克隆大規模測序后, 利用BLASTX在線比對后分析發現組織蛋白酶Cathepsin家族基因類似序列。該序列與縊蟶()Cathepsin家族cathepsin L3基因相似性最高, 一致性達到68%。將該序列其命名為青蛤CsCPL, 在Gen Bank的注冊號為KJ000064。

所獲得的青蛤CsCPL基因的cDNA序列全長1632bp, 5’UTR為74bp, 3’UTR為508bp, 開放閱讀框長度為1050bp, 編碼349個氨基酸(圖1), 理論分子量為38.84kDa, 理論等電點為5.48, 分子式為C1704H2625N465O540S18。氨基酸組成中甘氨酸(Gly)與絲氨酸(Ser)含量最高, 分別占8.9%和8.6%。其N端具有由15個氨基酸組成的信號肽序列MRVLVCLVALVACSV,前體酶原的前體肽含有ERF/WNIN模體(motif)和GNFD模體, 可形成1個α螺旋結構。其酶活性催化域含有4個催化位點(Gln149, Cys155, His294和Asn316), 兩條組織蛋白酶L簽名序列(E58X3RX3F/WX2NX3IX3N77和G90X1NX1FX1D96)。CsCPL的成熟肽定位于131—349, 預測等電點為4.41, 較前體肽略有下降, 含有7個半胱氨酸殘基。

2.2 青蛤CsCPL基因在不同組織內的表達

在鰻弧菌侵染青蛤條件下, 以b-actin在各組織中的表達量為內參對照, 利用實時熒光定量PCR分析了CsCPL基因在青蛤血淋巴、肝臟、外套膜、閉殼肌和鰓等五個組織的表達情況, 結果顯示CsCPL基因在青蛤的以上五個組織中普遍性表達(圖2), 但表達量存在明顯差異, 其中血淋巴中表達含量最高, 顯著高于其它組織(<0.05), 外套膜表達次之, 肝臟中含量最低, 表明CsCPL基因主要在血淋巴中表達。

圖1 CsCPL基因全長cDNA序列的開放閱讀框及結構域分析

方框為起始密碼子, * 表示終止密碼子, 下劃線表示CsCPL信號肽, 箭頭表示前體域切點, 陰影部分表示底物結合位點

圖2 CsCPL基因在青蛤不同組織中的表達情況

2.3 青蛤CsCPL基因在血淋巴中的時序性表達

在鰻弧菌侵染青蛤后, 以b-actin為內參基因, 利用實時熒光定量PCR分析了CsCPL基因在外套膜組織中的表達時序變化(圖3)。發現實驗組在感染后3h表達量顯著升高(<0.05); 并在6h表達量達到最大值, 并且與對照組差異極顯著(<0.01), 約為對照組的2.7倍左右; 24h后其表達量有所下降, 但仍顯著高于對照組(<0.01); 48—96h基因表達量逐漸降低并恢復至正常水平。而對照組除在6h有顯著升高外, 其余時間點均無明顯變化。

圖3 青蛤血淋巴CsCPL基因在鰻弧菌刺激不同時間相對表達量的變化

**表示相同時間點實驗組與對照組基因的轉錄表達水平差異極顯著(<0.01); ##表示該時間點對照組基因的轉錄表達水平與同組注射前(0h)相比差異極顯著(<0.01)

2.4 青蛤CsCPL基因的原核表達

CsCPL成熟肽基因PCR擴增, 產物長度約660bp的DNA片段, 與預期大小基本一致。PMD18T-CPL和pET-30a雙酶切后, 將目的片段和線性表達質粒經瓊脂糖凝膠檢測, 切膠回收, 目的片段大小約660bp(圖4), 符合預期。將CsCPL目的片段連接至pET-30a線性質粒, 轉化培養后, 進行陽性單克隆PCR檢測并送測序, 測序結果正確, 重組表達載體構建成功。

圖4 CsCPL重組序列PCR產物凝膠電泳結果

經IPTG誘導表達后, SDS-PAGE電泳檢測顯示: 誘導后的宿主菌蛋白表達圖譜發生了變化, 與未經誘導的對照樣品比較, 該工程菌株誘導后的樣品在約35kDa處產生了1條明顯的特異性電泳帶(圖5), 其分子量和理論計算值基本吻合。在誘導3h后, 表達量不再增加, 確定最佳誘導時間為3h。

圖5 考馬斯亮藍染色檢測融合蛋白的誘導表達

2.5 重組蛋白的純化復性與功能驗證

經親和層析分離純化后, 將得到的蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測, 結果顯示(圖6), 純化后的蛋白電泳條帶單一, 且分子量在35kDa處, 誘導后宿主菌蛋白圖譜中的特異性條帶位置一致, 可確定該純化后的蛋白就是青蛤CsCPL重組蛋白。

圖6 蛋白純化結果

注: 從左至右M泳道為蛋白Marker, 1泳道為未加IPTG誘導的空白對照, 2泳道為誘導4h在35kDa處出現目的帶, 3泳道為純化后的蛋白

重組蛋白抑菌實驗結果顯示(圖7), 重組蛋白CsCPL組菌生長曲線與陰性對照組(BSA)、空白(TBS)對照組相比趨勢明顯偏低, 菌群值明顯偏低, 說明與兩對照組相比, 重組蛋白CsCPL具有明顯的抑菌效果。但與陽性對照組(Lysozyme)相比其作用強度較低一些。

圖7 藤黃微球菌在重組蛋白及不同對照環境下的生長曲線

3 討論

本研究得到了青蛤組織蛋白酶L基因編碼區的全長, 經序列比對與分析發現, 該基因序列與許多水生動物的同源序列十分相似, 其結構在進化上相當保守。SDS-PAGE電泳檢測結果表明, 青蛤組織蛋白酶L的分子量約為35kDa, 與理論預期值基本吻合, 接近于三角帆蚌(白志毅等, 2011)血細胞組織蛋白酶L(37.7kDa)、海灣扇貝(李娟等, 2011)組織蛋白酶L(41.2kDa)、紅鰭東方鲀(梁靜真等, 2012)組織蛋白酶L(37.9kDa)、脊尾白蝦(段亞飛等, 2013)血細胞組織蛋白酶L(35.3kDa)等近緣物種中的分子量。通過對其蛋白序列的分析, 發現其氨基酸組成中, 甘氨酸與絲氨酸的含量最高。絲氨酸在新陳代謝與免疫因子的產生中發揮著作用, 而甘氨酸可作為水解蛋白的增效劑, 且可在人體中合成絲氨酸。組織蛋白酶(cathepsin)作為一類主要存在于溶酶體的蛋白水解酶, 近年來在無脊椎動物先天免疫調控方面的研究取得了較大進展。它與核糖核酸酶、b-葡萄糖醛酸酶、乙酰基轉移酶以及其它的蛋白酶一起參與溶酶體介導的蛋白質的消化及轉化過程(Mellman, 1996), 且具有水解多種肌肉相關蛋白的能力, 并參與非caspase介導的細胞凋亡過程(Chwieralski, 2006)。細胞凋亡是免疫調節的中心環節, 各種免疫細胞的代謝過程大多通過細胞凋亡實現(Krammer, 2000)。因此推測, 組織蛋白酶L在對內源與外源抗原的免疫反應中起著重要作用(S?derh?ll, 1998)。

本研究結果顯示, CsCPL作為一種免疫相關蛋白基因, 在青蛤各組織中的表達差異極其顯著, 基本表現為血淋巴>外套膜>鰓>閉殼肌>肝臟。分析其原因可能與CsCPL基因在生物體內的作用有關; 在正常情況下, 約90%的組織蛋白酶以酶原的形式貯存于溶酶體中, 隨時準備處理內源與外源性的抗原物質。鑒于雙殼類動物屬開管式血循環, 血淋巴中存在大量的酶源性物質, 并且作為其非特異性免疫防御的重要組織區域, 相比其它組織能夠更為迅速地上調CsCPL基因的表達水平。另外, 雙殼類在其濾食和呼吸時, 外套膜與鰓首先與海水接觸, 是其非特異性免疫的第一道防線, 具有重要的組織免疫防御作用(劉欣欣等, 2013)。

本研究中還發現, 在鰻弧菌侵染的青蛤血淋巴中的CsCPL基因表達量在6h達到最大值, 約為對照組的2.7倍, 與其它文獻如中華絨螯蟹(Li, 2010)和脊尾白蝦(段亞飛等, 2013)等報道的結果非常近似, 說明鰻弧菌侵染對CsCPL基因具有強烈的誘導作用。當青蛤受到該病原物侵襲時, 其免疫因子的相關基因啟動, 機體合成大量抗菌物質。在刺激后的12—24h, CsCPL表達量下降, 可能意味著機體處于感染后的恢復期(Sun, 2010), 類似情況也見于上述文獻中的研究結果。

本研究采用pET-30a作為表達載體系統, 構建了pET30α(+)-CPL重組質粒, 通過一個6×His標簽和T7啟動子來控制表達的嚴謹性。His標簽可與金屬螯合層析介質特異性吸附, 從而實現融合蛋白的分離與純化。由于His標簽較小, 一般不會影響目的蛋白的理化特征和生物學活性。本實驗獲得的融合蛋白大小在35kDa處左右, 與CsCPL分子量理論值38.84kDa基本吻合。另外, 本研究中的重組蛋白CsCPL組菌生長曲線與BSA、TBS對照組相比有明顯的抑菌作用, 但其作用效力不如溶菌酶Lysozyme顯著。推測原因可能是Lysozyme可溶解細菌細胞壁中的黏多糖而使使菌體直接降解, 而組織蛋白酶則通過參與細胞內酶原激活完成間接抗菌作用, 故其對菌體生長的抑制不如Lysozyme作用強烈。

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ANALYSIS OF EXPRESSION AND RECOMBINANT PROTEINS ACTIVITIES OF CATHEPSIN L GENE FROM

LIU Shi-Meng, ZHAO Ting, ZHANG Hao, PAN Bao-Ping

(College of Life Sciences, Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance, Tianjin Normal University, Tianjin 300387, China)

Measure the expression of Cathepsin L gene (CsCPL) between organizations instimulated byand time-dependent expression in hemolymph with RT-PCR method. The results showed that, CsCPL gene expresses abundantly in hemolymph, liver, mantle, gills and adductor muscle and other tissues in, with the highest expression level in hemolymph. The expression of CsCPL in hemolymph appeared a large number of increasement in 3—96 hours afterstimulation, and at 6 hours reach to maximum which was very significant different (<0.01) with the control group, indicating that CsCPL gene plays an important role in the immune response in. Experiments also carried on the CsCPL genetic prokaryotic expression, and got recombinant protein about 35 kDa molecular weight, which has an obvious bacteriostatic action after purification and renaturation.

; cathepsin L; Realtime PCR; bacteriostatic test

10.11693/hyhz20140100009

* 天津市科委應用基礎與前沿技術重點項目資助, 12JCZDJC22800號, 09JCZDJC19300號; 劉詩萌, E-mail: 934402617@qq.com

潘寶平, 博士, 教授, E-mail: p.baoping@gmail.com

2012-04-25,

2012-07-19

Q789