海洋微藻β-葡聚糖的生物活性分析*

周成旭 田 甜 陳海敏 嚴小軍 駱其君

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海洋微藻β-葡聚糖的生物活性分析*

周成旭①田 甜 陳海敏 嚴小軍 駱其君

(寧波大學海洋學院 寧波 315211)

為研究微藻來源的β-葡聚糖生物活性以及是否存在種間差異, 從6種海洋硅藻和定鞭藻(Haptophyte)中制備了β-葡聚糖, 進行了抗腫瘤、抗氧化、抑菌活性的分析和比較。6種微藻分別為: 中肋骨條藻()、三角褐指藻()、假微型海鏈藻()、柔弱角刺藻()、球等鞭金藻()、顆石藻(sp.)。研究結果顯示: 1. 微藻β-葡聚糖對Hela腫瘤細胞有細胞毒性: 濃度為50—100μg/mL時, 假微型海鏈藻β-葡聚糖的活性最高; 200μg/mL時, 顆石藻的最高, 但活性均未超過50%。2. 以DPPH和DCFH-DA兩種方法檢測抗氧化活性發現, 6種微藻β-葡聚糖均有濃度相關的抗氧化活性, 并且對氧自由基的清除率相對較高; 當β-葡聚糖濃度為400μg/mL時, 其清除率可達72%—74%。3. 對不同菌的作用有差異: 有濃度相關的抑制大腸桿菌的作用, 濃度為400μg/mL時, 抑菌率可達60%; 有促進金黃色葡萄球菌生長的作用, 其中, 僅中肋骨條藻的β-葡聚糖有濃度相關的作用。結果表明, 幾種硅藻和定鞭藻的β-葡聚糖生物活性功能相同, 都具有抗腫瘤、抗氧化以及抑菌或促菌作用, 活性大小與濃度有明顯的相關性。相同濃度或作用時間下, 其活性大小及活性飽和性具有微藻種間差異。這為研究和利用微藻及其天然產物提供了參考。

海洋微藻; β-葡聚糖; 抗腫瘤; 抗氧化; 抑菌活性

β-葡聚糖是葡萄糖單糖經β-糖苷鍵連接形成的聚合體, 分布在高等植物、細菌、真菌和海藻中, 可以顯著提高動物免疫力(Dalmo, 1995; 楊福剛等, 2005), 具有抗腫瘤、抗輻射、降血脂血糖(Braaten, 1994; Battilana2001; Chan, 2009)等功效, 常被稱作生物活性調節劑(Miura, 1996)。但是, 由于其活性功能或大小與不同生物來源相關(Vetvicka, 2007), 并且受聚合分子的空間結構差異影響大(諸葛健等,2002), 因而其基礎研究與應用方面尚存在爭議。

作為海洋生態系統中的初級生產者, 海洋微藻生物量巨大, 生長潛能高, 因適應海洋復雜生境而產生的生物多樣性高, 是天然產物的重要生物來源(Borowitzka, 1995)。海洋微藻中, 僅硅藻和定鞭藻(Haptophyte)兩類微藻產生具有活性的β型葡聚糖(Hirokawa, 2008; Kusaikin, 2010)。硅藻是海洋中生物量最大的一個微藻類群, 生長繁殖迅速。水產養殖上, 硅藻和定鞭藻的一些種類也是優質生物活餌料, 得到廣泛應用。其大量培養的技術成熟, 環境友好, 可作為天然產物生產的生物來源。

目前, 對海洋微藻β-葡聚糖提取方法、分子量測定、結構鑒定等方面有較多的研究 (V?rum, 1986; Kiss, 1988; Janse, 1996), 但是對不同微藻β-葡聚糖生物活性及生成機理研究較為缺乏(St?rseth, 2005; Hirokawa, 2008)。本研究從6種人工培養條件下生長快、生物量高、β-葡聚糖產量高的海產硅藻和定鞭藻中, 提取制備了β-葡聚糖, 分別進行了幾種生物活性的檢測和比較分析, 為微藻β-葡聚糖的基礎研究與開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

藻種:藻種均為寧波大學海洋學院微藻種質庫存種, 主要是水產養殖餌料微藻, 均可大量培養。

硅藻:中肋骨條藻(, 編號1)、三角褐指藻(, 編號2)、假微型海鏈藻(, 編號3)、柔弱角刺藻(, 編號4)

定鞭藻:球等鞭金藻(, 編號5)和顆石藻sp.(非餌料藻, 編號6)

1.2 實驗方法

1.2.1 藻種培養及β-葡聚糖的提取制備和檢測

以f/2培養基(Guillard, 1975)分別進行微藻的大量培養。在種群生長平臺期離心收集微藻, 制備凍干藻粉, 儲備足量后提取制備β-葡聚糖。

β-葡聚糖的提取及純化方法參考Hirokawa等(2008)以及Granum等(2002)專門針對β-葡聚糖的制備方法, 得到粉末狀葡聚糖。

β-葡聚糖的純度檢測: 剛果紅用來指示葡聚糖的3級結構, 僅與三螺旋β-1,3-1,6葡聚糖特異性結合產生光譜特征變化(Ogawa, 1972; Nitschke, 2011), 與其他類型的多糖不發生變化(Chihara, 1969), 是檢測具生物活性的β型葡聚糖含量相對快速簡易的方法。因此, 本研究以剛果紅法檢測產品中β型葡聚糖的含量(張娟等, 2007)。結果顯示, 產品純度分別為: 中肋骨條藻92%, 三角褐指藻93%, 柔弱角刺藻92%, 假微型海鏈藻94%, 球等鞭金藻91%, 顆石藻94%。本研究還以同樣的過程和方法提取、制備和檢測了其他類群的微藻, 包括小球藻和扁藻(綠藻)、東海原甲藻(甲藻)、赤潮異彎藻(針胞藻)等, 制備的糖均不與剛果紅產生顯色反應。

1.2.2 生物活性檢測方法

抗Hela腫瘤細胞毒活性檢測

采用MTT法檢測微藻β-葡聚糖對HeLa細胞的體外增殖抑制效應, 參照Boehm等(1997)的方法略有改動。將培養的宮頸癌Hela細胞(購于中國典型培養物保藏中心)用胰酶消化, 加于96孔板中, 使每孔細胞密度為(2—3)×104細胞/孔, 于37°C, 5%CO2培養箱中培養24h。將β-葡聚糖水溶液以5微升/孔的劑量加入上述96孔板中, 終濃度為0、50、100、200μg/mL, 各3平行, 置于原培養箱中繼續培養48h后, 各孔加入20μL 5mg/mLMTT (甲基噻唑藍, 購自德國Serva公司), 培養4h。棄培養液, 各孔加入150μL二甲基亞砜(DMSO), 振蕩至MTT完全溶解, 測定492nm處吸光值。

抑制率(blank-test)/blank×100% (1)

其中,blank為0μg/mL β-葡聚糖對照組的吸光值,test為實驗組的吸光值。

抗氧化活性檢測

(1) 對DPPH清除能力的檢測: 分別制備6種海洋微藻β-葡聚糖的50%乙醇溶液儲備液; 制備DPPH 90%乙醇溶液(0.15mmol/L)作為檢測試劑。將2μL各β-葡聚糖溶液加入200μLDPPH檢測試劑, 各β-葡聚糖實驗終濃度為0、50、100、200、400μg/mL。于25°C下避光反應30min, 以酶標儀測定492nm吸光值。各3平行。

DPPH清除能力1= (Blank–Test)/Blank×100% (2)

其中Blank是空白管的吸光值(=0min),Test是測試管的吸光值(=30min)。

(2) 以DCFH-DA檢測β-葡聚糖的抗氧化能力: 取0.5mL DCFH-DA甲醇溶液(1mmol/L), 加入2mL NaOH溶液(0.01mol/L)中, 室溫(25°C)下放置30min, 以10mL磷酸緩沖液(pH7.4)中和, 熒光劑終濃度為40μmol/L。于96孔板中依次加入100μL DCFH-DA熒光試劑、20μL β-葡聚糖溶液、40μL 5μmol/L的H2O2以及40μL 200mmol/L的FeSO4, 各3孔平行。β-葡聚糖實驗終濃度為: 0、50、100、200、400μg/mL。于25°C下暗處放置1h。以熒光分光光度計分析熒光強度(Ex/Em=488nm/525nm)。樣品清除自由基的能力按照公式(3)計算:

DCFH-DA清除能力2=

(Test–Blank)/(Control–Blank)×100% (3)

其中Blank是未加樣品和H2O2的空白孔熒光值,Test是測試孔的熒光值,Control是未加樣品的對照孔熒光值。

抗菌活性檢測

參考駱健美等(2011)的方法, 以100mLLysogeny Broth(LB)液體培養基接種大腸桿菌()和金黃色葡萄菌(), 37°C培養12h。于96孔板上進行檢查: 空白對照組為200μL無菌培養基; 菌液對照組為100μL菌液加100μL無菌培養基, 細菌數107—108ind./mL; 實驗組加入100μL菌液和100μL無菌培養基, 依次加入10μL各海洋微藻β-葡聚糖, 終濃度為50、100、200、400μg/mL。37°C靜置培養12h。期間, 每3h以酶標儀測定600nm下的吸光值。

抑菌率以培養12h結果按照公式(4)計算:

抑菌率= (R–)/(R–B) × 100% (4)

其中R是菌液對照組吸光值;B是空白對照組吸光值;是實驗組吸光值。

對出現抑菌現象的實驗組, 分析了作用時間(0、3、6、9、12h)對抑菌效果的影響。

1.3 數據處理

采用單因素方差分析進行差異顯著性檢驗(杜榮騫, 2003)

2 結果

2.1 抗腫瘤細胞毒活性

以MTT法檢測不同微藻β-葡聚糖對Hela細胞的作用發現, 6種微藻β-葡聚糖對宮頸癌Hela細胞均有細胞毒性, 且受葡聚糖濃度大小影響(圖1): 濃度為50—100μg/mL時, 假微型海鏈藻的β-葡聚糖細胞毒最高; 濃度為200μg/mL時, 顆石藻的β-葡聚糖細胞毒最高。各檢測濃度下, 最高致死率均不超過50%。球等鞭金藻和顆石藻的β-葡聚糖活性與濃度呈線性相關(2=0.99), 中肋骨條藻的β-葡聚糖活性最低, 但是與濃度正相關。

圖1 各微藻β-葡聚糖對Hela細胞的抑制率

1. 中肋骨條藻(); 2. 三角褐指藻(); 3. 假微型海鏈藻(); 4. 柔弱角刺藻(); 5. 球等鞭金藻(); 6. 顆石藻(sp.)

2.2 抗氧化活性

6種微藻β-葡聚糖對DPPH和氧自由基的清除率如圖2所示, 濃度在0—400μg/mL時, 微藻β-葡聚糖對DPPH和氧自由基的清除率隨β-葡聚糖濃度增加而增加, 對氧自由基的清除率在各濃度下均明顯大于對DPPH的清除率。

圖2 各微藻β-葡聚糖對DPPH和氧自由基(基于DCFH-DA)清除率

分析相同濃度(400μg/mL)對DPPH和氧自由基清除率發現(圖3), 6種微藻β-葡聚糖對DPPH的清除率介于12%—26%, 其中, 假微型海鏈藻β-葡聚糖對DPPH的清除率略高, 但僅為25.12%。對氧自由基的清除率達50%—72.9%, 其中假微型海鏈藻β-葡聚糖的清除率最大。相同濃度下, 不同微藻葡聚糖對同一種自由基的清除率有顯著差別(<0.01)。

2.3 抗菌活性

2.3.1 抑菌率 微藻β-葡聚糖對大腸桿菌12h抑菌率如圖4所示。抑菌率隨β-葡聚糖濃度增加而增加。其中, 三角褐脂藻和柔弱角刺藻β-葡聚糖在濃度為0—200μg/mL時, 與抑菌率呈正相關, 濃度達400μg/mL后, 不再明顯上升。其他4種微藻β-葡聚糖在0—400μg/mL范圍, 抑菌率與濃度正相關。其中假微型海鏈藻、球等邊金藻和顆石藻的最高濃度下抑菌活性顯著高于其他3種(<0.01)。

圖3 各微藻β-葡聚糖在相同濃度(400μg/mL)下對DPPH和氧自由基(基于DCFH-DA)清除率

1. 中肋骨條藻(); 2. 三角褐指藻(); 3. 假微型海鏈藻(); 4. 柔弱角刺藻(); 5. 球等鞭金藻(); 6. 顆石藻(sp.)

圖4 各微藻β-葡聚糖對大腸桿菌抑制率

1. 中肋骨條藻(); 2. 三角褐指藻(); 3. 假微型海鏈藻(); 4. 柔弱角刺藻(); 5. 球等鞭金藻(); 6. 顆石藻(sp.)

微藻β-葡聚糖作用于金黃色葡萄球菌的結果(12h)如圖5所示, 對金黃色葡萄球菌有一定的促生長作用。其中, 中肋骨條藻的葡聚糖促進作用與濃度明顯相關, 且促生長能力高。其他的不表現濃度相關性, 且最大促進力低。

圖5 各微藻β-葡聚糖對金黃色葡萄球菌的影響

1. 中肋骨條藻(); 2. 三角褐指藻(); 3. 假微型海鏈藻(); 4. 柔弱角刺藻(); 5. 球等鞭金藻(); 6. 顆石藻(sp.)

2.3.2 抑菌與時間的關系 微藻β-葡聚糖對大腸桿菌的抑制作用與時間相關性如圖6所示。當葡聚糖濃度較低(50μg/mL和100μg/mL), 抑菌率與時間均呈線性相關。當β-葡聚糖濃度較高(200μg/mL和400μg/mL), 除中肋骨條藻和顆石藻, 其他微藻β-葡聚糖抑菌曲線均呈“S”型, 說明高濃度下, 抑菌作用隨時間增加易飽和的特點。

3 討論

不同微藻代謝產生多種形態的多糖聚合物, 但是, 僅β-D-(1,3)(1,6)葡聚糖具有生物活性, 且該類葡聚糖只存在于硅藻、定鞭藻, 如硅藻和定鞭藻的金藻昆布糖()(Kusaikin, 2010)。本研究同期分析的結果也顯示, 其他類微藻不能產生具有生物活性的b-葡聚糖。

多糖活性檢測研究大多是針對酵母、真菌、細菌或大型藻(如海帶)等生物體來源的葡聚糖進行分析, 對微藻來源的β-葡聚糖活性檢測的研究很少, 不同微藻β-葡聚糖的活性差異比較研究尚未見報道。本研究從4種硅藻和2種定鞭藻中提取了β-葡聚糖, 檢測了抗腫瘤、抗氧化及抗菌活性。結果顯示, 各藻來源的葡聚糖都具有Hela腫瘤細胞毒活性、抗氧化活性、抑菌或促菌活性, 具有的活性功能基本一致。

圖6 微藻β-葡聚糖對大腸桿菌抑制率隨時間的變化特征

1. 中肋骨條藻(); 2. 三角褐指藻(); 3. 假微型海鏈藻(); 4. 柔弱角刺藻(); 5. 球等鞭金藻(); 6. 顆石藻(sp.)

葡聚糖的生物活性與其分子量、空間結構等關系密切(Vetvicka, 2007)。對微藻來源的β-葡聚糖研究顯示, 微藻葡聚糖分子量小(Oyama, 2006), 可溶性高, 多是β-(1,3)糖苷鍵連接成主鏈, 在葡萄糖單位C2和C6連接帶有β-(1,6)糖苷鍵的支鏈, 其聚合度在16—60, 分子量在(2.5—10)×104Da(McConville, 1986; Paulsen, 1978), 沒有顯著差異?？赡茉斐闪藥追N微藻來源的葡聚糖活性功能相同的特點。

雖然結構、功能相近, 但是微藻β-葡聚糖的生物活性在作用濃度、活性大小以及時間效應上有顯著的種間差異。本研究的抗腫瘤細胞毒活性中, 柔弱角刺藻、假微型海鏈藻和三角褐指藻葡聚糖增加至最高實驗濃度時, 其活性增速會降低; 球等鞭金藻和顆石藻的活性與作用濃度在實驗范圍內則始終呈線性相關, 可能在濃度更高時才會出現活性飽和。微藻葡聚糖抗氧化活性則均與實驗濃度呈線性相關。相同濃度下, 顆石藻和假微型海鏈藻葡聚糖的抗氧化活性相對較高, 且對大腸桿菌的抑菌率也相對較高。研究較多的真菌來源的葡聚糖活性分析也顯示, 各種真菌來源的葡聚糖結構和功能基本相近, 但是對不同腫瘤細胞的抗腫瘤效應、以及在不同細胞中產生反應, 特別是不同細胞因子的表達和產物有所不同(Borchers, 1999)。

葡聚糖的活性由其空間結構及分子量大小決定, 其作用機理與受體的空間結構相關, 其飽和過程或許是相互作用部位的空間占位(Ariizumi, 2000; Brown, 2001)。葡聚糖的生物活性還受宿主自身的代謝調節, Takeyama等(1987)發現, 真菌灰樹花()多糖抗腫瘤活性受宿主巨噬細胞和T細胞作用明顯, 宿主的代謝活動顯著影響多糖的活性。其活性還跟注射途徑和作用時間有關系(Suzuki, 1987)。葡聚糖的純度、與蛋白的結合度等也可能對活性功能與大小產生影響(Kidd, 2000; Ebina, 2001), 因此不只是生物來源的差異, 跟生產過程、提取過程均有相關性。

微藻葡聚糖與其他生物來源的葡聚糖比較時, 活性功能的差異更明顯。抑菌檢測中, 我們同時還對燕麥葡聚糖標準品抑菌活性進行了分析, 發現燕麥葡聚糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌不產生作用。牛宏彥等(2010)用酵母β-葡聚糖在體外對大腸桿菌實驗也沒有抑制作用。海洋微藻提取物抑菌活性的物質本質多為多糖、蛋白質、脂肪酸等(St?rseth, 2005), 其抑菌性尚有很多問題未解決, 如抑、促菌特征及機制、作用方式以及對細菌和真菌的抑制比較等方面的問題。本研究中, 骨條藻葡聚糖具有濃度相關的顯著促進金黃色葡萄球菌生長的特征, 與其他各藻葡聚糖活性大小差別較大。其作用機理尚待從幾種微藻葡聚糖的結構特征、細菌對葡聚糖的利用代謝特征等方面進行研究。關于不同生物來源的葡聚糖活性機理及功能差異機制的研究都還很缺乏。

對不同微藻β-葡聚糖活性進行分析, 主要有兩個方面的研究與應用價值。一是在基于微藻大量培養的產業鏈上開發活性物質生產目標; 另一方面, 由于微藻處于水生生物圈的食物鏈基礎位置, 在自然生態系統或人工養殖活動中, 作為食物來源的微藻其營養價值或生物活性價值與捕食者的攝食選擇和營養優化密切相關。硅藻與定鞭藻的很多種類是浮游動物的重要食物來源, 也是水產養殖中的優良活餌料。本研究的微藻, 除顆石藻外, 均為水產養殖餌料微藻。作為餌料微藻, 假微型海鏈藻的推廣應用相對其他幾種餌料藻稍顯少一些。假微型海鏈藻的餌料效果優良(作者交流), 從本文結果來看, 其生物活性高, 不失為一種好的餌料選擇。雖然顆石藻種群生長迅速, 但由于顆石藻的環境生態效應復雜(周成旭等, 2008; 蔣瑩等, 2009), 需謹慎選擇。

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BIOACTIVITIES OF Β-GLUCAN IN SIX MARINE MICROALGAE

ZHOU Cheng-Xu, TIAN Tian, CHEN Hai-Min, YAN Xiao-Jun, LUO Qi-Jun

(School of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

The biological activity of β-glucan in different organisms varies significantly. We studied the bioacitivity, in terms of cytotoxicity, antioxidation, and antimicrobe, of β-glucans extracted from mass cultures of six strains of marine diatom and haptophyte, namely,,,,,, andsp. The results show that β-glucan from each microalgal strain showed moderate cytotoxicity on Hela cells. The most potent β-glucan was fromin concentration ranged 50-100 μg/ml, andsp. at 200 μg/ml. β-glucan fromandsp. show good positive concentration-cytotoxcitiy correlation. Moreover, β-glucan from all the strain was concentration-relevant in antioxidation against reactive oxygen and DPPH; for example, at 400μg/ml, β-glucan could remove 72% to 74% reactive oxygen. However, the effects on microorganism by β-glucan differed among the strains. For instances, β-glucan from marine microalga could inhibit the growth ofup to 60% at the concentration of 400 μg/ml, but promote the growth of(best for β-glucan from). The activities were concentration- and time- dependent. Significant difference may exist among the microalga at the same glucan concentration, calling for more works in the future.

microalgae; β-glucan; anticancer; antioxidation; antimicrobial

10.11693/hyhz20121120001

* 國家科技支撐計劃課題, 2011BAD13B08號; 浙江省重點科技創新團隊: 海洋生物技術產業科技創新項目, 2010R50029號; 浙江省自然科學基金項目, Y506131號, LY12D06001號; 海洋可再生能源專項資金項目, GHME2001SW02號

周成旭, 副研究員, Email: zhouchengxu@nbu.edu.cn

2012-11-20,

2013-02-27

Q17