中部太平洋大眼金槍魚(Thunnus obesus)種群遺傳結構的初步研究*

吳智超 許強華, 2, 3, 4 許柳雄, 2, 3, 4 戴小杰, 2, 3, 4 朱江峰, 2, 3, 4

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中部太平洋大眼金槍魚()種群遺傳結構的初步研究*

吳智超1許強華1, 2, 3, 4①許柳雄1, 2, 3, 4戴小杰1, 2, 3, 4朱江峰1, 2, 3, 4

(1. 上海海洋大學海洋科學學院 上海 201306; 2. 大洋漁業資源可持續開發省部共建教育部重點實驗室 上海 201306; 3. 農業部大洋漁業資源環境科學觀測實驗站 上海 201306; 4. 國家遠洋漁業工程技術研究中心 上海 201306)

大眼金槍魚()是世界最重要的漁業資源之一, 經濟價值較高, 捕撈壓力的加大使中部太平洋大眼金槍魚過度捕撈程度愈發嚴重。開展種群遺傳結構研究將為大眼金槍魚資源的可持續利用與開發提供科學依據。本文以取自中西太平洋和中東太平洋共182尾大眼金槍魚個體為研究對象, 分析研究其線粒體DNA控制區第一個高變區(the first hypervariable region, HVR-1)457bp的序列, 共發現115個變異位點, 定義了178種單倍型。序列多樣性分析結果顯示: 8個采樣點核苷酸多樣性在0.03074—0.04362之間, 單倍型多樣性在各個采樣點都較高, 變動范圍在0.996—1.000之間; 分子方差分析顯示99.97%的遺傳變異性來自于種群內; 群體間的高基因交流值m和低分化指數st揭示中東太平洋與中西太平洋群體間基因交流頻繁, 不存在顯著的遺傳分化。

大眼金槍魚(); 種群遺傳結構; 線粒體DNA; 控制區

大眼金槍魚()隸屬于鱸形目(Perciformes)、鯖亞目(Scombroidei)、鯖科(Scombridae)、金槍魚屬(), 是世界最重要的漁業資源之一, 經濟價值較高, 分布在太平洋、大西洋、印度洋的熱帶、亞熱帶和溫帶廣闊水域(趙傳絪等, 1983; 苗振清等, 2003), 在我國主要分布在東海和南海(苗振清等, 2002)。WCPFC(中西太平洋漁業委員會)的評估報告指出, 2008年中西太平洋大眼金槍魚的漁獲量雖然從2007年的14.3萬噸增至15.7萬噸, 但其捕撈壓力已超越可持續生產的水平, 資源正在進一步惡化(Fonteneau, 2005)。另外, 在海洋漁業中, 漁獲物經常由多個原始群組成, 盡管這些原始群在種群形態上十分相似, 但是在種群遺傳結構上還可能進行種群再分。不加區別的捕撈, 將會導致一些微弱原始群的衰退或滅絕。弄清大眼金槍魚的種群遺傳結構將有助于掌握其生活史、估算種群數量及資源變動, 從而為大眼金槍魚資源的可持續利用和開發提供科學依據(Excoffier, 1992)。

對大眼金槍魚種群的分子遺傳分析始于1962年Suzuki(1962)的工作, 之后利用分子標記對大眼金槍魚種群遺傳結構的研究層出不窮。Grewe和Hampton(1998)同時利用線粒體DNA標記和微衛星標記對太平洋內的大眼金槍魚進行了系統研究, 兩種標記的分析結果都認為太平洋內大眼金槍魚不存在遺傳分化。Alvarado-Bremer等(1998)和Chow等(1993, 2000)在利用PCR-RFLP技術研究大洋間大眼金槍魚遺傳結構時, 也證明了太平洋大眼金槍魚呈現單一的遺傳結構。因此, 這之后的幾年間, 學界都公推這一結論。由于線粒體DNA的控制區進化速率最快(Brown, 1983), 且能夠有效地檢測出傳統生物學方法無法識別的種群分化, 線粒體DNA控制區已成為群體遺傳學中最有效的分子標記(Ravaoarimanana, 2004)。而在這其中, 線粒體DNA控制區第一個高變區(the first hypervariable region, HVR-1)標記越來越多地成為研究魚類種群遺傳結構的首選(Falk, 2003)。Martinez等(2006)和Chiang等(2006)先后將HVR-1分子標記應用到大眼金槍魚種群遺傳結構的研究中。Chiang等(2006)以西太平洋大眼金槍魚為研究對象, 證實西太平洋大眼金槍魚是一個隨機交配的種群, 但鄰接樹和最小跨度網絡揭示了兩種線粒體世系的存在。同樣, 王中鐸等(2012)利用線粒體控制區標記分析認為, 南海大眼金槍魚群體與東太平洋群體間存在較顯著的分化, 而與西太平洋群體分化不顯著。

作為連接東太平洋與西太平洋的海體, 中部太平洋的大眼金槍魚群體遺傳結構如何呢？鑒于中部太平洋擁有非常重要的金槍魚漁場, 且目前還沒有關于該海域大眼金槍魚群體遺傳結構的研究, 本研究將利用線粒體DNA控制區HVR-1分子標記, 對中部太平洋大眼金槍魚野生群體進行種群分析, 以期為大眼金槍魚的資源保護與合理利用提供重要的理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2009年10月至2011年2月分別由3艘商業漁船作業采集到大眼金槍魚182尾(表1), 其中中西太平洋5個采樣點, 分別命名為WP1—WP5, 中東太平洋3個采樣點, 分別命名為EP1—EP3(圖1)。剪取大眼金槍魚的肌肉組織樣本, 將其固定在裝有95%酒精的離心管并凍存于-20°C冰箱, 備用。

1.2 DNA提取、PCR擴增和測序

大眼金槍魚肌肉樣本DNA的提取采用標準的苯酚-氯仿抽提法。電泳后用紫外分光光度計檢測DNA濃度和純度。

用于擴增線粒體控制區的引物(Alvarado-Bremer, 1998)為L15998-PRO(5′-TACCCCAAACTCCC-A-A-AGCTA-3′)以及CSBDH(5′-TGAATTAGGAACC-AGATGCCAG-3′)。PCR擴增反應體系為20μL：1.0× PCR反應緩沖液2μL; 基因組模板DNA(10μg/mL) 1μL; Taq酶(5U/μL)0.12μL; dNTP(2.5mmol/L)1.6μL; 引物(10μmol/L)各0.5μL; 剩余用ddH2O補足。PCR反應在Eppendorf熱循環儀上進行, 反應條件為：95°C預變性3min; 95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 1min, 共30個循環; 72°C延伸10min; 4°C保存。PCR產物純化后由上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

1.3 數據分析

利用ClustalX1.83軟件對控制區序列進行多重比對, 并輔以手工校正。采用MEGA4.0軟件統計DNA序列的堿基組成, 通過鄰接法基于Kimura雙參數模型構建系統發育樹, 并用bootstrap的方法重復1000次進行檢驗。利用TCS1.21軟件構建單倍型間的系譜關系, 簡約上限為默認值95%。單倍型多樣性指數()與核苷酸多樣性指數()由軟件DnaSP version 4.00來進行計算。采用ARLEQUIN version3.0軟件分析種群間分化指數st, 通過1000次重抽樣來檢驗群體間st值的顯著性。另外, 對大眼金槍魚遺傳結構進行的分子方差分析也在ARLEQUIN version3.0中完成。基因流m根據公式M=1/4(1/st?1)得出。

2 結果

2.1 基因序列多樣性

經PCR擴增后, 獲得182個長為457bp的線粒體控制區HVR-1序列, 發現115個變異位點, 變異率為25.16%, 定義了178個單倍型。序列中各堿基在DNA雙鏈中平均所占的比例為：A(腺嘌呤)=35.4%, T(胸腺嘧啶)=28.9%, C(胞嘧啶)=22.0%, G(鳥嘌呤)=13.7%, A/T堿基對含量64.3%明顯高于C/G堿基對含量35.7%。群體內線粒體DNA控制區HVR-1單倍型多樣性指數()和核苷酸多樣性指數()見表2。單倍型多樣性指數在8個采樣點都很高, 平均值達0.9998, 核苷酸多樣性介于0.03074—0.04362之間, 最高值出現在EP3采樣點, 最低值出現在WP5采樣點。

表1 大眼金槍魚采樣位點, 采樣時間及采樣數目

Tab.1 The sampling locations, date and number of Thunnus obesus

圖1 大眼金槍魚采樣位點

182尾大眼金槍魚個體中共檢測到178種單倍型。除了單倍型49在采樣點EP2和EP3同時出現外, 其他單倍型均為對應各采樣點特有。另外, 還有其他3種單倍型也都不是為一個個體所獨有, 分別是單倍型39、62以及131, 對應的取樣點為EP2、EP1、WP5(表3)。

表2 大眼金槍魚線粒體DNA控制區HVR-1的遺傳多樣性參數

表3 各采樣位點的大眼金槍魚單倍型分布

Tab.3 Haplotype distribution of Thunnus obesus in different localities

2.2 系統發育樹和單倍型網絡的構建

基于178種線粒體DNA控制區HVR-1單倍型構建的NJ系統發育樹結果顯示：各單倍型廣泛分布在單倍型鄰接樹上, 未形成明顯的分支, 不存在顯著的譜系結構。基于HVR-1構建的單倍型間系譜關系顯示：178種單倍型只形成單一的一個網絡, 各單倍型間呈現高水平的平行演化(圖略)。

2.3 群體遺傳結構分析

采用AMOVA分析評估大眼金槍魚的群體遺傳結構, 分析結果表明99.97%的變異組分來自種群內; 而只有0.03%的變異組分出現在種群間(表4)。利用st進一步檢驗大眼金槍魚群體的群體遺傳結構。根據兩兩群體間的st值大小可以發現：所有的st值都較小, 并且除了WP3群體與EP3群體間統計檢驗極其顯著(=0.00901)外, 其他任何兩個群體間的統計檢驗都不顯著。結果暗示采樣區域內大眼金槍魚不存在顯著的遺傳結構(表5)。除此之外, 8個采樣點間大眼金槍魚的基因交流m也非常頻繁, WP3群體與EP3群體間基因流最小, 為6.75(表5)。

表4 大眼金槍魚種群的分子方差分析

Tab.4 AMOVA analysis on Thunnus obesus populations

表5 采樣區域間大眼金槍魚種群的st分析及基因流m

Tab.5 Fst analysis and Nm values of Thunnus obesus populations between sampling regions

st值位于斜線下方;m值位于斜線上方; *差異顯著(<0.05); **差異極其顯著(<0.01)。值采用1000次重復來進行估計。

3 討論

Fonteneau等(2005)指出, 除了西太平洋大眼金槍魚過度開發程度較小外, 東太平洋、印度洋以及大西洋大眼金槍魚都處于嚴重過度捕撈的程度。為了更好地進行大眼金槍魚的管理和保護工作, 業內將大西洋、太平洋和印度洋大眼金槍魚分別作為各自單一的群體, 并由四大國際性委員會：ICCAT(大西洋金槍魚類保護委員會)、IATTC(美洲熱帶金槍魚委員會)、WCPFC(中西太平洋金槍魚養護委員會)以及IOTC(印度洋金槍魚委員會)來進行管理。中西太平洋擁有太平洋最大的金槍魚漁場, 對該范圍及附近海域大眼金槍魚的群體遺傳學研究將為合理保護與利用該漁業資源提供理論依據。

本研究182尾大眼金槍魚樣本中, 132尾取自中西太平洋, 50尾取自中東太平洋。利用線粒體DNA控制區HVR-1標記, 本研究共鑒定出178種單倍型, 中西太平洋和中東太平洋分別具有131和48種單倍型, 與樣本數量也基本相同。此項結果表明中部太平洋海域大眼金槍魚擁有極高的單倍型多樣性指數, 這與許多學者對其他大洋性洄游魚類線粒體控制區片段特征的描述相吻合(Grant, 1998; Carlsson, 2004)。另外, 對樣本線粒體DNA控制區HVR-1片段的序列分析顯示A+T含量遠遠高于C+G含量, 這與之前學者關于線粒體DNA控制區堿基組成的研究也相一致(Brown, 1986)。

分子方差分析顯示99.97%的變異組分來自種群內; 而只有0.03%的變異組分出現在種群間, 種群內差異遠遠大于種群間差異。對兩兩群體間進行st分析顯示除了WP3群體與EP3群體間統計檢驗極其顯著(=0.00901)外, 其他任何兩個群體間的統計檢驗都不顯著。而基于線粒體DNA控制區HVR-1單倍型構建的NJ系統發育樹和單倍型間系譜關系網絡圖均顯示不存在顯著的譜系結構, 這些分析結果暗示大眼金槍魚在中部太平洋不存在顯著的遺傳結構。根據Liu等(2006)對鳀魚的研究發現, 由于海洋作為一個大的水體, 魚類在其內能相對自由的運動并且海洋環流能夠幫助輸送海洋魚類的卵和幼體, 因此海洋魚類群體的遺傳分化一般都比較低, 不易形成顯著的遺傳結構。所以我們可以推測：本研究中所采集的中西太平洋和中東太平洋樣本間較小的遺傳分化可以歸因于個體間頻繁的基因交流。

而事實上, 在赤道附近盛行東北信風和東南信風, 兩種方向不同的信風驅使海水向兩側分流, 使得在東太平洋的赤道地區的冷水上翻來補充被分流的海水, 此為東太平洋的冷水區。相反, 赤道太平洋表層暖的海水也被輸送至西太平洋, 海平面上升, 熱量不斷積累, 此為西太平洋的暖池區(陳雪冬等, 2006)。一般冷暖水團的相遇區由于生產力較高, 常形成天然的漁場。中部太平洋集合了這一特點(周甦芳等, 2004), 其兩側的水團驅使中西太平洋和中東太平洋大眼金槍魚群體在產卵季節不斷涌入該區域進行繁殖, 使得兩個群體間的基因交流較高。在Chiang等(2006)的研究中, 根據HVR-1區域單倍型構建的鄰接樹和最小跨度網絡揭示了西太平洋兩種線粒體世系的存在。而本研究基于HVR-1單倍型構建的NJ系統發育樹和單倍型間系譜關系圖均未表現出遺傳分化的跡象, 猜測這可能與西太平洋和中部太平洋分別具有獨立的大眼金槍魚漁場, 其間的基因交流相對較少有關。另外, 由于本研究中, 中東太平洋海域擁有的樣本總量較少, 甚至個別采樣點采樣數目較低(EP2=14, EP3=12), 這可能影響了中東太平洋內的遺傳分化結果。但總的來看, 我們可以認為, 中部太平洋只存在一種隨機交配的大眼金槍魚群體, 種群內部不存在顯著的遺傳分化。

作為太平洋金槍魚漁場最大的集中地, 中部太平洋大眼金槍魚的管理和保護工作由兩個金槍魚管理組織(IATTC和WCPFC)共同進行。本研究初步確定中西太平洋與中東太平洋大眼金槍魚無明顯遺傳分化, 這一結果支持將中部太平洋大眼金槍魚作為單一管理單元進行管理; 它同時也提示管理中部太平洋大眼金槍魚的兩個金槍魚管理組織(IATTC和WCPFC)應該彼此協調, 制訂相對比較統一的管理策略。值得一提的是：本研究中的中東太平洋海域采樣樣本數量相對不足(表1), 需要在今后的研究中進一步增加采樣點和樣本數, 以期獲得更可靠的實驗結果。

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POPULATION GENETIC STRUCTURE OFIN CENTRAL PACIFIC OCEAN

WU Zhi-Chao1, XU Qiang-Hua1, 2, 3, 4, XU Liu-Xiong1, 2, 3, 4, DAI Xiao-Jie1, 2, 3, 4, ZHU Jiang-Feng1, 2, 3, 4

(1. College of Marine Sciences, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Key Laboratory of Sustainable Exploitation of Oceanic Fisheries Resources, Ministry of Education, Shanghai 201306, China; 3. Scientific Observing and Experimental Station of Oceanic Fishery Resources, Ministry of Agriculture, Shanghai 201306, China; 4. National Distant-water Fisheries Engineering Research Center, Shanghai 201306, China)

Overexploitation of bigeye tuna in the Central Pacific Ocean has become a serious concern. We investigated the population genetic structure aiming at providing scientific references for the sustainable development of the resources. In this study, 182 bigeye tuna specimens were sampled from the Central Pacific Ocean. Population genetic diversity was evaluated by using the sequence data of the first HVR-1 (hypervariable region, HVR-1) of mitochondrial control region. In total, 115 variable sites were observed and 178 haplotypes were identified. Analysis of mtDNA HVR-1 sequences of bigeye tuna from eight localities with the nucleotide diversities ranged 0.03074-0.04362 and high haplotype diversities ranged 0.996-1.000. AMOVA test of bigeye tuna revealed that 99.97% of the genetic variation occurred within populations. Lowst(fixation index) values and high gene flow (m) values revealed in this investigation indicate no significant genetic differentiation and high rates of gene flow between the Central Western Pacific bigeye tuna populations and the Central Eastern Pacific bigeye tuna populations.

bigeye tuna; population genetic structure; mitochondrial DNA; control region

10.11693/hyhz20121021001

* 上海市捕撈學重點學科專項基金項目, S30702號; 國家863計劃, 2012AA092303號。吳智超, E-mail: wuzhichao1988@126.com

許強華, 教授, E-mail: qhxu@shou.edu.cn

2012-10-21,

2013-01-18

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