微生物法快速檢測食品中維生素B12含量的應用研究

（廣東省廣州市質量監督檢測研究院）

維生素是維持人體生長發育及新陳代謝而必須從食物中獲得的微量有機物質之一。許多食品會添加維生素，但強化維生素應符合適宜人群的攝入量，應能在特定條件下保持質量的穩定。加大對維生素檢測方法及技術的研究，對科學控制維生素在食品中的添加量具有重要的意義。

維生素B12(VB12)，又稱鈷胺素（Cobalamin），是非常重要的水溶性維生素之一，主要用于保健食品、谷物、飲料、乳品和嬰兒食品的營養強化。由于食品成分復雜、存在多種干擾因素，而且其VB12的含量十分微量，因此化學分析法的應用受到限制。目前，微生物法仍為國際官方機構測定VB12的的首選認可方法。

雖然微生物法在維生素檢測過程中有較高的靈敏度和精確度[1]，但是仍然存在步驟繁瑣、操作耗時、檢測周期長、易受外部因素干擾等諸多問題[2]。本文建立了微生物法測定食品中VB12含量的快速方法，與傳統微生物檢測法相比具有檢測周期短、操作步驟簡便、結果準確性與重現性高的優勢。

1 材料

1.1 試驗菌株

試驗菌株為萊士曼氏乳酸桿菌（Lactobacillus leichmanniii），ATCC 7830，來源為美國典型培養物保藏中心。

1.2 培養基

培養基為：乳酸桿菌肉湯培養基，乳酸桿菌瓊脂培養基，VB12測定培養基；均來自BD（碧迪醫療器械（上海）有限公司上海辦事處）。

1.3 標準品

標準品為VB12，來自USP（上海安譜科學儀器有限公司）。

1.4 緩沖液

無水磷酸氫二鈉0.65 g（廣州化學試劑廠），無水偏重亞硫酸鈉0.01 g（上海化學試劑總廠），一水合檸檬酸0.6 g（廣州化學試劑廠）；用100 mL蒸餾水溶解制得緩沖液，使用前配制。

1.5 試驗樣品

試驗樣品為：SRM 1849a（NIST，National Institute of Standards and Technology）、配方乳粉、配方米粉、含乳飲料、功能飲料。

2 試驗方法

2.1 菌種的制備

將乳酸桿菌肉湯培養物離心洗去肉湯培養基，并使用含有甘油的測定培養基進行適宜的稀釋，加入96排管中，零下80 ℃凍存。

2.2 標準溶液的制備

VB12標準工作溶液的濃度為1.25 ng/mL，在無菌條件下使用無菌濾器過濾備用。

2.3 操作步驟

2.3.1 樣品的處理

（1）配方乳粉、含乳飲料等樣品：稱2～5 g樣品，充分溶解后加入緩沖液水解，在無菌條件下使用無菌濾器過濾，根據樣品中的VB12的標稱含量進行稀釋。

（2）配方米粉等樣品：稱2～5 g樣品，加入淀粉酶溶液酶解，滅活后在無菌條件下使用無菌濾器過濾，根據樣品中VB12的標稱含量進行稀釋。

（3）功能飲料等樣品：在無菌條件下使用無菌濾器過濾得到樣品溶液，根據樣品中維生素B12的標稱含量進行稀釋。

2.3.2 標準曲線的制備

在無菌條件下，按表1順序在滅菌小管中對VB12標準品進行稀釋，制備相應濃度的標準曲線溶液。

表1 VB12標準曲線溶液的制備

將凍存有試驗接種菌懸液的小管恢復到室溫，在每管中加入300 μL系列標準曲線溶液和300 μL無菌維生素B12測定培養基，一式3 份。使用渦旋振蕩器混合。

2.3.3 樣品測定液

在無菌條件下，按表2順序在滅菌小管中對樣品測定液進行稀釋，制備相應濃度的樣品測定溶液。

將凍存有試驗接種菌懸液的小管恢復到室溫，在每管中加入300 μL系列樣品測定溶液和300 μL無菌VB12測定培養基，一式3 份。使用渦旋振蕩器混合。

2.3.4 培養

（36±1.0）℃培養24～28 h。

2.3.5 測定

混合均勻，使用酶標儀進行讀數。平行小管相對偏差小于15%的為有效數值。

表2 VB12樣品測定液的制備

3 結果與分析

3.1 標準曲線的繪制

以標準曲線管VB12含量做橫坐標，以吸光度做縱坐標，根據四參數方程擬合標準曲線，結果如圖1所示。標準曲線相關系數達到0.9989。

3.2 VB12含量的計算

根據每管的吸光值從標準曲線查得對應的VB12含量，除以相對樣液體積（v），得到每管樣品溶液中VB12含量。由所有有效管中測得的數值計算平均值（Cx）。樣品中VB12含量按下列公式計算：

m（g）為樣品質量，f為樣品稀釋倍數。

以SRM 1849a、配方乳粉、配方米粉、含乳飲料、功能飲料為試驗樣品，每種樣品作6 次平行試驗，檢測結果見表3。所測數據表明該方法測定VB12含量有效，重復性良好。

圖1 VB12含量測定標準曲線

3.3 樣品加標回收試驗

選擇已知維生素B12含量的配方乳粉作為加標試驗樣品，在樣品稀釋液中加入一定體積的維生素B12標準溶液，加標量分別為25.0，50.0，100.0 ng，進行3 次重復試驗，試驗結果如表4所示；回收率為94.2%～103.1%，試驗靈敏度高。

表3 VB12含量檢測結果

表4 加標回收試驗結果

4 討論

4.1 與國標方法GB 5413.14—2010《食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測定》[3]的比較

國家標準方法為傳統微生物法，存在步驟繁瑣、操作耗時、檢測周期長、易受外部因素干擾等諸多問題。

在本方法中，試驗體系的體積縮小，標準溶液和樣品溶液的制備可以使用1.2 mL小管和移液器進行操作，使得操作更加簡便、準確，且代替了大量的容量瓶、試管和移液管等，既節省了人工也避免了雜質、活性物質等對試驗結果的影響。本文方法將試驗菌株預先固定在96排管，利用甘油保護冷凍的菌種[4]，極大地縮短了試驗周期，在提高試驗效率的同時，使菌株的活力更加穩定，保證了試驗的有效性。在維生素檢測過程中有較高的靈敏度和精確度。

4.2 與商品化維生素檢測試劑盒的比較

商品化維生素檢測試劑盒的優點在于操作步驟簡便[5]，但是其配套標準溶液的保藏與制備是影響試驗結果準確性的關鍵因素，并且如果樣品溶液只做一個稀釋度進行檢測也會極大地影響結果準確性。同時試劑盒價格十分昂貴，加重了維生素檢驗的負擔。

在本文方法中，標準溶液的制備準確可靠，樣品溶液采取多個濃度進行檢測，保證了試驗結果的準確性和重現性。同時采用小管進行培養，更利于試驗溶液的充分混勻并減少了試驗污染風險。

4.3 技術要點總結

在微生物法檢測微量維生素含量試驗中，試驗菌種的活力是影響試驗結果的關鍵因素， 標準曲線的繪制是影響試驗結果的直接因素。試驗過程中須注意避免雜質對試驗菌株生長的影響。在制備樣品測定液的過程中，須注意稀釋液的均勻性，并采用適宜的稀釋倍數。微量稀釋過程中要保證準確性。

4.4 微生物法測定VB12含量的優點

維生素分析檢測工作對于評價食品營養價值、控制強化食品中維生素的加入量具有重要意義。微生物法測定VB12含量的快速方法，操作步驟簡便，有利于建立有效的試驗流程和質量管理，保證了試驗的有效性和結果的準確性，適于在常規實驗室建立和應用。

[1]Gregory M E. The microbiological assay of Vitamin B12in the milk of different animal species. British Journal of Nutrition，1954（8）：340-347.

[2]張麗宏，王克新，王淼，等. 微生物法測定乳粉中維生素B12的應用和探討. 中國乳品工業，2008，36（10）：58-60.

[3]GB 5413.14—2010 食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測定.

[4]Grossowicz N，Waxman S，Schreiber C. CryoprotectedLactobacillus casei：an approach to standardization of microbiological assay of Folic acid in Serum. Netherlands Journal of Immunological Methods，1981，46（2）：129-140.

[5]黃曉林，王淼，張麗宏，等. IFP微孔板試劑盒檢測配方乳粉中維生素B12方法探討. 中國乳品工業，2010（7）：48-49.