亞甲基四氫葉酸還原酶基因C667T多態性與冠狀動脈慢血流現象的關系研究

吳堅 唐歐杉 秦豐明 成銀宏 陳鐘良 陳麗娜 周浩亮 陶楓 童海江

亞甲基四氫葉酸還原酶基因C667T多態性與冠狀動脈慢血流現象的關系研究

吳堅 唐歐杉 秦豐明 成銀宏 陳鐘良 陳麗娜 周浩亮 陶楓 童海江

目的 觀察亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因C677T多態性與中國南方漢族人群中冠狀動脈慢血流現象（CSFP）的關系，進一步探討遺傳因素在CSFP發病中的意義。方法收集經冠狀動脈血管造影證實冠脈正常的患者214例作為研究對象，并利用校正的TIMI幀數法（CTFC）分組為慢血流組（143例）和對照組（71例），應用焦磷酸測序法（Pyrosequencing）檢測患者C677T基因表型，分析MTHFR基因C677T多態性與CSFP的關系。結果慢血流組MTHFR基因（TT+TC）基因型和T等位基頻率均明顯高于對照組（69．2%、49．3%，χ2=8．05，P＜0．01；42．7%、29．6%，χ2=6．87，P＜0．01），慢血流組男性比例明顯高于對照組（59．4%、36．6%，χ2= 9．90，P＜0．01），同型半胱氨酸(Hcy)和尿酸(UA)水平明顯高于對照組（P＜0．05或0．01），慢血流組葉酸(FA)和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平明顯低于對照組（P＜0．05），Logistic回歸分析均顯示（TT+TC）基因型[OR=1．962，95%CI（1．049～3．669），P＜0．05]、Hcy水平升高 [OR=1．087，95%CI（1．012～1．168），P＜0．05]、男性 [OR=2．507，95%CI（1．347～4．664），P＜0．01]和UA水平升高[OR=1．008，95%CI（1．003～1．013），P＜0．01]患者CSFP發病風險增加。結論MTHFR基因C677T多態性與CSFP發病相關，攜帶T等位基因可能是中國南方漢族人群冠狀動脈慢血流現象發病的危險因素之一。

冠狀動脈慢血流現象 同型半胱氨酸 同型半胱氨酸代謝相關酶 基因多態性

冠狀動脈慢血流現象（coronaryslow flow phenomenon，CSFP）被定義為一種在冠狀動脈造影中沒有發現心外膜冠狀動脈存在明顯狹窄病變，而對比劑灌注遠端血管延遲的現象。最早由Tambe等[1]在1972年報道了6例存在該現象的典型心絞痛患者。雖然截止目前關于該現象的研究數量有限，但主流觀點認為微血管功能障礙是引發該現象的主要原因，而具體引起血管功能異常的因素尚處于不斷探索階段。同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）作為一種含巰基氨基酸，在巰基氧化過程中產生具有內皮毒性反應的活性氧產物，損傷內皮細胞功能，而高Hcy血癥已被認為是心血管相關疾病的獨立危險因素，現已有少量研究[2-3]發現Hcy水平升高可能是CSFP發病的危險因素之一，而亞甲基四氫葉酸還原酶（Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是葉酸和Hcy代謝的一個關鍵酶。本研究通過觀察研究對象中MTHFR基因C677T多態性，分析其與CSFP的關系，進一步探索遺傳性因素在發病中所起作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料 2011-06—2013-06在我院因疑診冠狀動脈粥樣硬化性心臟病而行冠狀動脈血管造影證實冠脈正常的患者214例作為研究對象，均為紹興地區及其鄰近區域漢族人，按校正的TIMI幀數法（CTFC）分為慢血流組143例和對照組71例。排除標準：充血性心力衰竭、心臟瓣膜性疾病、限制型心肌病、肥厚型心肌病、擴張型心肌病、房室傳導異常、冠脈痙攣、冠脈瘤樣擴張、冠脈彌漫性病變、正服用抗凝或抗血小板凝聚藥物、慢性肺部疾病、嚴重肝腎功能不全、結締組織疾病及可引起高血漿Hcy的相關疾病或在服用相關影響藥物。

1.2 冠狀動脈血流測量方法 應用PHILIPS Allura Xper FD20數字血管造影機，采用Judkins法，左前降支（LAD）、左回旋支（LCx）采集體位為右前斜30°，右冠狀動脈（RCA）取左前斜50°，采集速度為15幀/s。按Gibson等[2]描述的CTFC由2位介入醫師分別觀察記錄血流幀數，結果取均值。記錄幀數以30幀/s校正。本研究慢血流入選標準：血管造影正常，任一血管血流幀數＞27（其中LAD血流幀數除以1.7校正）。

1.3 MTHFR基因型測定 采用生工生物（上海）有限公司的血液基因組DNA快速抽提試劑盒提取基因組DNA。參照 GenBank中 MTHFR基因序列，利用PRIMER5.0軟件設計包含C677T多態性位點的PCR引物：上游引物5′-TCA TCC CTA TTG GCA GGT TAC-3′，下游引物5′-CAA AGC GGA AGA ATG TGT CA-3′，測序引物5′-GAG AAG GTG TCT GCG GGA-3′，其中下游引物5′末端進行生物素標記；PCR反應體系總體積為50μl，含5×Green Gotaq reaction Buffer 10μl，MgCl2（25mM）6μl，引物各0.5μl，dNTPs 1μl，TagDNA聚合酶1U，余用ddH2O補全。PCR反應條件：95℃預變性5min，95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環后，72℃延伸1min，16℃，終止反應。利用PyroMark Q96 ID焦磷酸測序儀進行PCR產物的焦磷酸測序。生物素及PCR反應體系均為Promega公司產品。

1.4 臨床檢驗數據測定 所有患者在禁食至少8h基礎上抽取外周靜脈血進行相關指標檢測。空腹血糖（FBG）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、肌酐（Cr）、尿酸（UA）、Hcy均采用OLYMPUS AU2700+ISE大型全自動生化分析儀測定，其中Hcy測定采用循環酶法；纖維蛋白原（FIB）測定采用免疫比濁法；葉酸（FA）測定采用固相放免法；平均血小板體積（MPV）測定采用Coulter LH750血細胞分析儀。

1.5 心臟超聲指標測定 利用西門子SEQUOIA 512彩色多普勒采集系統測定患者左室舒張末內徑（LVEDd）和左室收縮功能（LVEF）。

1.6 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件，連續性正態分布計量資料用表示，組間比較采用t檢驗，非正態分布連續計量資料采用M（QR）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。組間計數資料比較采用χ2檢驗。利用Pearson相關分析連續性變量間的相關性，而分類變量采用Kendall’s tau-b方法。以是否為慢血流患者為應變量，作多元逐步Logistic回歸分析（向后：Wald法），對CSFP影響因素進行篩選。應用擬合優度χ2檢驗分析基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2 結果

2.1 兩組患者的基礎臨床資料比較 見表1。

表1 兩組患者的基礎臨床資料比較

由表1可見，兩組患者年齡、吸煙、飲酒、高血壓病、糖尿病、收縮壓及舒張壓差異均無統計學意義（均P＞0.05），而慢血流組男性比例顯著高于對照組（P＜0.01）。

2.2 臨床檢測數據及CTFC比較 見表2。

由表2可見，兩組患者TG、TC、LDL-C、FBG、Cr、FIB、MPV、LVEF、LVEDd無統計學差異，慢血流組Hcy高于對照組（P＜0.05），UA高于對照組（P＜0.01），HDLC、FA低于對照組（P＜0.05）。慢血流組3支血管CTFC均顯著高于對照組（P＜0.001），兩組患者平均CTFC分別為37.6（32.3，45.5）和22.2（20.3，23.4）（P＜0.001）。2.3 MTHFR基因型比較 根據焦磷酸測序儀結果判斷基因型（圖1），慢血流組中CC、CT和TT基因型的頻率為30.8%、53.1%和16.1%，對照組中為50.7%、39.4%和9.9%，各組基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律（χ2=1.067、0.202，P＞0.05）。其中慢血流組TT+ TC型頻率和T等位基因頻率均顯著高于對照組（χ2= 8.05、6.87，P＜0.01），詳見表3。

表2 兩組患者臨床檢測數據及CTFC比較

表3 兩組患者基因型和等位基因頻率比較

2.4 單因素相關分析 平均CTFC與Hcy（r=0.380，P＜0.001）、男性（r=0.331，P＜0.001）、TT+TC基因型（r= 0.176，P＜0.05）和飲酒（r=0.169，P＜0.05）呈正相關、與FA（r=-0.315，P＜0.001）呈負相關；Hcy與TT+TC型呈正相關（r=0.171，P＜0.05），與FA呈負相關（r=-0.508，P＜0.001）。

2.5 多元逐步Logistic回歸分析 以慢血流與否為應變量，應用單因素分析篩選出Hcy、性別（男性=1，女性= 0）、基因型（TT或TC=1，CC=0）、HDL-C、FA、UA進入逐步回歸分析，結果示TT+TC基因型、Hcy、男性、UA與CSFP發病相關，詳見表4。

圖1 MTHFR C677T基因型焦磷酸測序結果（a）為CC基因型（b）為TT基因型（c）CT基因型

表4 CSFP發病影響因素的Logistic回歸分析

3 討論

截至目前尚沒有一個明確的機制來闡述冠狀動脈慢血流現象是如何發生的，而冠脈微血管功能失調被認為與CSFP有關。1996年Mangieri等[4]對慢血流患者的左室心肌活檢進行了研究后發現細胞水腫、毛細血管損傷和微血管管腔變小，進一步電鏡發現細胞核形態不規則，核漿固縮等現象，他們推測以上改變使得遠端血流阻力增加從而導致了血流減慢，支持了微循環阻力升高是慢血流現象主要原因的假說。Sezgin等[5]研究發現，CSFP患者存在內皮功能失調，血漿一氧化氮（NO）水平和血流介導的血管擴張較正常對照組顯著降低，可見血管內皮細胞的功能在冠脈微循環調節中也起到重要作用，故有相當數量的研究圍繞內皮細胞功能展開，Tanriverdi等[6]發現CSFP患者丙二醛、超氧化物歧化酶水平增高，還原型谷胱甘肽水平減低，證實了高Hcy所致的高氧化應激反應損傷血管內皮功能，可能在CSFP發病中起一定作用。現有證據已經明確Hcy可通過高氧化應激反應直接損傷血管內皮功能，同時Hcy可抑制一氧化氮合酶的合成和活性、抑制L精氨酸的轉運，從而減少NO的生成，使NO降解增加，引起微血管舒張功能減退。本研究結果也同樣顯示，慢血流組Hcy水平明顯高于正常血流組。而多元逐步Logistic回歸分析也同樣顯示Hcy是CSFP發病的危險因素之一。本研究的發現男性比女性更易發生CSFP，與Hawkins和Nie等[7-8]研究相同。Camsari等[9]借助超聲和IVUS發現CSFP患者冠脈存在彌漫性內膜增厚和（或）節段性鈣化，冠脈內膜平均厚度均較對照組明顯增加。故這些學者認為CSFP為早期動脈粥樣硬化的一種表現形式。同時發現UA可能是CSFP發病的預測因素之一，與Yibliz等[10]研究結果相同。雖然慢血流組HDL-C較對照組明顯減少，與戴宇翔等[11]研究結果相同，多元回歸分析未支持其與CSFP發病相關。

已有研究發現MTHFR基因存在多種突變類型，而C677T基因多態性是學者研究最多的，它是目前發現的MTHFR基因最常見的不耐熱錯義突變，不易受外界環境的影響，是單核苷酸多態性位點。MTHFR C677T突變使其活性下降，熱敏感性增高，從而使Hcy轉硫基和甲基化過程出現障礙而誘發Hcy升高。Arai等[12]的研究證實，TT基因型個體有較高的血漿Hcy水平。現有數據表明MTHFR基因C677T基因多態性可能與多種疾病發病相關，其中就包括冠心病。歐洲9個國家一個協作項目對711例心血管患者和747例對照者進行的研究表明，特別是當血漿Hcy升高和葉酸降低時，MTHFR基因C677T突變T純合基因型是心血管疾病的風險因子[13]，而目前針對MTHFR基因突變與CSFP的相關性尚無文獻報道，本研究發現慢血流組TT+TC型頻率要顯著高于對照組[OR=2.314，95%CI（1.289～4.155）]，T等位基因頻率也高于對照組[OR=1.771，95%CI（1.152～2.722）]。進一步Logistic回歸分析同樣證明T等位基因攜帶者CSFP發病率增高 [OR=1.962，95%CI（1.049～3.669）]，表明攜帶T等位基因可能是CSFP發病的危險因素之一。

本研究雖然發現MTHFR基因C677T多態性可能是CSFP發病的危險因素之一，但未入選如BMI等已知及其他未知的可能影響因素，有待進一步研究作出解答報道。

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Association of MTHFR polymorphisms with risk of coronary slow flow phenomenon

Objective To investigate the association of methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR)C677T polymorphisms with risk of coronary slow flow phenomenon(CSFP)．MethodsOne hundred and forty three patients with CSFP and 71 controls were included in this study．CSFP were diagnosed by the corrected TIMI frame count method．The polymorphisms of MTHFR C677T were determined by pyrosequencing in two groups．ResultsThe TT and TC genotype frequency,and T allele frequency in CSFP patients were higher than those in the controls(69．2%,49．3%,χ2=8．05,P＜0．01;42．7%,29．6%,χ2=6．87,P＜0．01)．Male to female ratio was higher in CSFP group(59．4%,36．6%,χ2=9．90,P＜0．01)than in controls．Serum homoeysteine (Hcy)and uric acid(UA)levels were higher,folic acid and high-density lipoprotein cholesterol levels were lower in CSFP patients than those in controls(P＜0．05 and 0．01)．After other risk factors were adjusted,TT and TC genotype(OR=1．962,95%CI 1．049～3．669,P＜0．05),Hcy(OR=1．087,95%CI 1．012～1．168,P＜0．05),male sex(OR=2．507,95%CI 1．347～4．664,P＜0．01)and UA (OR=1．008,95%CI 1．003～1．013,P＜0．01)were independent risk factors for CSFP．ConclusionThe high frequency of allele T in MTHER gene C677T may be a risk factor for CSFP in the southern Chinese population．

Coronary slow flow Homocysteine Homocysteine metabolism related enzymes Gene polymorphism

2014-04-14）

（本文編輯：田云鵬）

浙江省醫學會臨床科研基金項目（2011ZYC-A90）

312000 紹興第二醫院心血管內科

唐歐杉，E-mail：tangoushan@medmail.com.cn