紅景天苷對百草枯中毒大鼠肺組織保護作用的研究

鄭蘭芝 張卓一 黃小民 徐儷穎 陸如鳳 周晶晶 丁黎敏

●論 著

紅景天苷對百草枯中毒大鼠肺組織保護作用的研究

鄭蘭芝 張卓一 黃小民 徐儷穎 陸如鳳 周晶晶 丁黎敏

目的 通過觀察紅景天苷對百草枯中毒大鼠肺組織轉化生長因子-β1（TGF-β1）表達、TNF-α含量和血清IL-6水平的影響，探索其對肺損傷的保護作用。方法將90只SD大鼠隨機分為正常對照組、百草枯模型組、紅景天苷治療組，后兩組再分為1、6、24、72h 4個亞組，每組10只。百草枯模型組和紅景天苷治療組采用百草枯溶液1ml/kg一次性灌胃制備急性百草枯中毒肺損傷模型，然后分別予等容積的0．9%氯化鈉溶液、紅景天苷1ml/kg腹腔注射。3組大鼠麻醉后，取股動脈血測定IL-6水平，處死后取肺組織，觀察病理變化，采用免疫組化和RT-PCR測定肺組織中TGF-β1及其mRNA的表達情況，并測定肺組織中TNF-α含量。結果百草枯模型組大鼠肺組織出現大片出血及壞死，紅景天苷治療組大鼠肺組織損傷程度較百草枯模型組減輕。與正常對照組比較，百草枯模型組、紅景天苷治療組肺組織6、24、72h TGF-β1表達顯著增加(均P＜0．01)，但紅景天苷治療組較百草枯模型組為低(均P＜0．05)。百草枯模型組與紅景天苷治療組中毒后第1h起大鼠肺組織TGF-β1mRNA水平開始增加，但紅景天苷治療組較百草枯模型組為低（均P＜0．05）。與正常對照組比較，百草枯模型組及紅景天苷治療組肺組織中TNF-α含量、血清IL-6水平從第6h開始顯著增加(均P＜0．01)，但紅景天苷治療組在各時點均較百草枯模型組為低(均P＜0．05)。結論TGF-β1參與了百草枯中毒大鼠肺損傷的早期病理生理過程，紅景天苷能抑制TGF-β1的表達，降低肺組織TNF-α含量、血清IL-6水平，從而減輕百草枯對大鼠肺組織的損傷。

紅景天苷 百草枯中毒 急性肺損傷 轉化生長因子-β1

百草枯是一種高效季胺類除草劑，有觸殺和傳導性作用，其除草效果好且價格便宜，可以增加工作效率。百草枯接觸泥土后，能迅速分解失效，毒性降低，因而是一種對土壤沒有傷害的除草劑，但如經消化道和呼吸道直接吸收進入人體，則對人體傷害極大，其中以急性肺損傷最為顯著，可波及多器官系統[1-2]。隨著百草枯廣泛應用，百草枯中毒發生率逐漸增加，已經是一個世界性的公共衛生問題，在亞洲地區尤為突出，統計顯示，有機磷農藥中毒是最主要的中毒性疾病，其中百草枯中毒病死率最高，病死率＞50%[3-4]。百草枯中毒的高病死率除了與其本身的高毒性有關，還與其缺乏有效的治療手段有關。目前臨床上仍以對癥治療及血液凈化治療為主，暫無有效、理想的治療手段。因此尋找一種有效治療百草枯中毒的方法甚為迫切。紅景天苷是從藏藥紅景天分離的一種苯乙醇類化合物，是紅景天的主要有效成分，具有抗炎、抗缺氧、抗腫瘤、抗衰老及抗肝纖維化等作用，對大鼠燒傷繼發的肺損傷和肺功能障礙具有明顯治療作用[5-9]。本研究前期實驗證實[10]，紅景天苷對百草枯中毒大鼠急性肺損傷Toll樣受體4（TLR4）和核轉錄因子-κB（NF-κB）mRNA表達水平具有抑制作用，能保護百草枯中毒大鼠引起的急性肺損傷。在此基礎上，筆者進一步觀察百草枯中毒大鼠肺組織轉化生長因子-β1（TGF-β1）mRNA表達水平，以及肺組織TNF-α含量和血清IL-6水平，探討紅景天苷對百草枯中毒大鼠急性肺損傷的保護作用及機制，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠90只，體重190～210g，清潔級；由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供，并在清潔級環境下采用標準顆粒飼料和標準飲用水按常規飼養。動物生產許可證號：SCXK（z）2008-0022，動物使用許可證號：SYXK（z）2008-0115，并通過倫理審批。百草枯為山東三元工貿有限公司產品，批號：GB19308-2003，濃度20%；紅景天苷為中國藥品生物制品檢定所產品，批號：CY90076，純度＞98%；TGF-β1試劑盒為美國Invitrogen公司產品，免疫組化試劑盒購自武漢博士德公司。逆轉錄試劑盒由日本TaKaRa公司提供。TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒均為中國深圳NeoBioscience公司產品。多功能真彩色細胞圖像分析管理系統為美國Media Cybernetics公司Image-Pro Plus。

1.2 動物分組和模型制備 將實驗大鼠隨機分為3組：（1）正常對照組10只；（2）百草枯模型組 40只（再分為4個亞組，分別為百草枯中毒后1、6、24、72h組，各10只）；（3）紅景天苷治療組40只（再分為4個亞組，分別為紅景天苷治療后1、6、24、72h組，各10只）。采用一次性灌胃百草枯溶液制備急性百草枯中毒肺損傷模型，灌胃劑量：百草枯（20%百草枯原液稀釋10倍）1ml/kg灌胃，紅景天苷治療組予等量百草枯灌胃；正常對照組予等容積的0.9%氯化鈉溶液灌胃。紅景天苷治療組在百草枯灌胃中毒后即刻予腹腔注射紅景天苷（采用純紅景天苷干粉稀釋至1%濃度）1ml/kg，每隔12h腹腔注射1次。百草枯模型組及正常對照組予腹腔注射相同劑量的0.9%氯化鈉溶液，每隔12h腹腔注射1次。

1.3 方法

1.3.1 標本采集與檢測 正常對照組在1h后予10%水合氯醛0.4ml/100g麻醉，股動脈取血后處死大鼠；百草枯模型組和紅景天苷治療組分別在中毒后1、6、24、72h予10%水合氯醛0.4ml/100g麻醉，股動脈取血后處死大鼠；3組大鼠均取右中上肺組織。分離血清，將肺組織于-70℃冰箱中保存待測。

1.3.2 肺組織病理檢測結果 將肺組織用4%甲醛固定，石蠟包埋，行蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肺組織病理學變化。

1.3.3 肺組織中TGF-β1的表達 采用免疫組化法測定。取大鼠肺組織0.5cm×0.5cm×0.1cm組織塊進行固定、包埋、切片及染色等處理，利用顯微鏡觀察，隨機選取5個視野，采用計算機圖像處理軟件測定各組肺組織TGF-β1含量，以免疫組織化學染色陽性單位表示，陽性細胞數分級分為：0～1%、1%～10%、10%～50%、50%～80%、80%～100%，分別計為0、1、2、3和4分；陽性細胞顯色強度分為陰性、弱陽性、陽性和強陽性，分別計為0、1、2和3分，免疫組化評分（IHS）=陽性細胞數分級×陽性細胞顯色強度分級。

1.3.4 肺組織中TGF-β1mRNA的表達 采用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測。用Trizol一步法抽提肺組織總RNA，根據引物設計原理和在PUBMED數據庫中查找待檢測基因的DNA、mRNA及內參GAPDH序列，采用引物設計軟件Primer Premier5.0設計上游和下游引物，引物序列詳見表1。采用20μl體系反轉錄制備CDNA，反應體系為0.4 μl、PCR Reverse Primer（10μmol/L）0.4 μl、ROX 0.4 μl、DNA模板2.0 μl、dH2O（滅菌蒸餾水）、6.8 μl，退火溫度60℃30s進行定量RT-PCR檢測。

表1 熒光實時定量PCR反應各個基因特異性引物

1.3.5 肺組織中TNF-α含量測定 取大鼠肺組織約0.5g，加入1ml預冷的0.9%氯化鈉溶液研磨勻漿，離心后取上清液，按試劑盒的說明書進行操作。

1.3.6 血清中IL-6水平測定 常規分離獲得血清，按試劑盒的說明書進行操作。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料以表示，各組間數據比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，計數資料組間比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 大鼠百草枯中毒表現 大鼠中毒后 0.5h即開始出現精神不佳，進食、進水量減少，萎靡、瞇眼、拱背、反應遲鈍、呼吸加快，6h后出現口唇紫紺、張口呼吸，甚至呼吸窘迫等，24～72 d癥狀進行性加重，呼吸系統最為明顯，伴隨體重下降、腹瀉及血尿等；紅景天苷治療組大鼠上述中毒表現有所減輕。百草枯模型組大鼠死亡12只（30.0%），紅景天苷治療組大鼠死亡5只（12.5%），兩組間差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 肺組織病理改變 HE染色顯示正常對照組大鼠肺泡結構清晰，肺泡壁薄，肺泡內未見水腫液，肺間質無炎性細胞浸潤（圖1A，見插頁）。百草枯模型組1h出現明顯毛細血管擴張、充血等肺泡炎癥表現（圖1B，見插頁），6h后肺泡間隔明顯增寬，肺泡腔內充滿滲出的水腫液，部分有透明膜形成（圖1C，見插頁），24～72h肺組織炎癥、滲出明顯，伴有出血、壞死及炎性細胞浸潤，細支氣管黏膜上皮損傷部分脫落,肺泡壁上大量炎癥細胞浸潤，可見肺泡結構萎陷，肺不張、肺氣腫（圖1D、E，見插頁）。紅景天苷治療組各時點肺組織病理改變與百草枯模型組相似，但病變程度相對較輕（圖1F～I，見插頁）。

2.3 各組大鼠肺組織TGF-β1的表達 與正常對照組比較，第6h起百草枯模型組的肺組織TGF-β1表達陽性細胞計數及免疫組化評分顯著增加（P＜0.01），在第72h達到最大值，紅景天苷治療6、24、72h組TGF-β1表達陽性細胞計數及免疫組化評分增加下降，差異有統計學意義（P＜0.05），詳見表2、3。

表2 各組大鼠肺組織TGF-β1表達陽性細胞計數的比較（%）

表3 各組大鼠肺組織TGF-β1表達免疫組化評分的比較（分）

2.4 各組大鼠肺組織TGF-β1 mRNA表達的比較 結果表明，大鼠中毒后1h開始肺組織中TGF-β1 mRNA表達量開始增加，隨著時間發展，TGF-β1 mRNA表達量逐漸增加，而紅景天苷治療組大鼠肺組織中TGF-β1 mRNA表達量改變相對較小，差異有統計學意義（P＜0.05），詳見表4。

表4 各組大鼠肺組織TGF-β1 mRNA表達的比較

2.5 各組大鼠肺組織中TNF-α含量的比較 與正常對照組相比較，從第6h起百草枯模型組及紅景天苷治療組的肺組織勻漿中TNF-α含量顯著增加（P＜0.01），并且隨著時間的延長而不斷提高，在第72h達到最大值；紅景天苷治療組中TNF-α含量增加較百草枯模型組相對較少，與百草枯模型組的差異有統計學意義（P＜0.05），詳見表5。

表5 各組大鼠肺組織中TNF-α含量的比較（pg/ml）

2.6 各組大鼠血清中IL-6水平的比較 與正常對照組比較，從第6h起百草枯模型組和紅景天苷治療組大鼠血清中的IL-6水平有顯著增加（P＜0.01），并隨著時間的延長而不斷增加；紅景天苷治療組中IL-6水平增加相對較少，與百草枯模型組相比差異有統計學意義（P＜0.05），詳見表6。

表6 各組大鼠血清中IL-6水平的比較（pg/ml）

3 討論

百草枯口服吸收后，由于肺組織存在聚胺類物質攝取系統，百草枯能夠逆濃度梯度在肺組織中聚集，約為血漿濃度的6～10倍[11]，肺組織損傷最為突出，而且肺組織的百草枯清除速度比其他組織的清除速度明顯慢。早期肺組織損傷以肺泡上皮損傷，出血性水腫，炎癥細胞浸潤為主，晚期則出現肺泡內及間質纖維化[12]。本實驗證實百草枯中毒后1h，肺組織病理切片HE染色即發現毛細血管擴張、充血，6h后肺泡腔內充滿滲出的水腫液，部分有透明膜形成等肺泡炎癥表現，24～72h肺組織炎癥、滲出明顯，部分有出血、壞死，細支氣管黏膜上皮損傷部分脫落，肺泡壁上大量炎癥細胞浸潤，可見肺泡結構萎陷，肺不張，紅景天苷治療組各時點肺組織病理改變與百草枯模型組相似，但病變程度相對較輕。

近年來肺損傷、肺纖維化發病機制的研究進展發現，多種細胞因子如TGF-β1、TNF-α、IL-6等參與了肺損傷、纖維化的發生、發展，其中TGF-β1作為一個關鍵的多肽類生長因子，具有調節細胞生長、分化、凋亡等不同的生物活性，在急性肺損傷、肺纖維化發生的過程中，通過趨化巨噬細胞和成纖維細胞，誘導相關炎癥細胞釋放，促進炎癥反應發生；TGF-β1還可通過上調細胞外基質（ECM）表達，增加肺內ECM沉積；促進成纖維細胞對膠原及纖維結合蛋白的合成，參與肺損傷、肺纖維化形成[13]；此外，還可以通過影響其他致纖因子如血小板衍生因子（PDGF）、TNF-α加速肺損傷、肺纖維化形成[14]。TGF-β被公認為肺損傷、纖維化形成與發展的啟動樞紐。百草枯中毒可通過多種途徑引起細胞因子發生變化，有研究表明其中TNF-α和IL-6與ALI/ARDS關系最為密切[15]。TNF-α主要由活化的單核/巨噬細胞和T淋巴細胞產生，在炎癥反應中具有始動和關鍵的促炎免疫作用。IL-6由T細胞、B細胞、單核細胞、成纖維細胞及內皮細胞等多種細胞產生，主要功能是誘導B細胞生長、分化并產生免疫球蛋白，形成免疫復合物，造成肺損傷。紅景天是景天科草本植物，多分布于高寒地帶，《四部醫典》提及紅景天“性平，味澀，善潤肺、補腎、理氣養血”，現代藥理學研究證實，紅景天提取物具有抗衰老，增強免疫，減少炎癥細胞浸潤保護心肌[10]、抗氧化及中樞神經系統的雙向調節作用[16]。紅景天苷是紅景天的主要有效成分，既往研究表明，紅景天苷通過抑制肺組織中炎癥介質及抗氧化作用可以改善脂多糖和油酸所致急性肺損傷[9]，紅景天苷亦可以通過抑制博萊霉素致大鼠肺纖維化模型肺組織的MMP-2、TIMP-1的合成及分泌，在一定程度上調整其比值使其趨于平衡，減輕博萊霉素所致大鼠的肺損傷[17]。本研究結果表明，紅景天苷治療中毒大鼠后，免疫組化顯示肺組織TGF-β1上升幅度有所下降，陽性細胞數及TGF-β1基因表達量相對較小，差異有統計學意義，說明紅景天苷能夠減輕百草枯中毒大鼠肺損傷的程度。紅景天苷作用機制較為復雜，從多種途徑參與百草枯中毒肺損傷保護，而其中作用機制之一可能通過降低TGF-β1的表達而發揮作用。紅景天苷治療組肺組織TNF-α含量及血清IL-6水平于中毒后各時間點較百草枯模型組均有顯著降低，差異有統計學意義，提示紅景天苷能減輕百草枯中毒大鼠肺臟的炎癥損傷，可為臨床治療提供依據。

百草枯中毒治療為臨床治療難題，而本研究發現TGF-β1、TNF-α和IL-6參與了百草枯中毒后肺損傷的病理生理過程，紅景天苷能夠有效抑制TGF-β1的表達，降低肺組織中TNF-α含量及血清IL-6水平，從而減輕百草枯中毒后大鼠肺組織的損傷程度，延緩肺纖維化的進程，本實驗進一步闡明了紅景天苷治療百草枯中毒肺損傷的可能機制，為臨床治療百草枯中毒提供了理論基礎。

[1]Dinis oliveira R J,Duarte J A,Sanchez Navarro A,et al．Paraquat poisonings:mechamismsof lung toxicity,clinical features,and treatment[J]．Crit Rev Toxicol,2008,38(1):13-15．

[2]Yamashita M,Ando Y．A long-term follow-up of lung function in survivors of paraquat poisoning[J]．Hum Exp Toxicol,2000,19(2): 99-103．

[3]Bertolote J M,Fleischmann A．Deaths from pesticide poisoning:a global respons[J]．Br J Psychiatry,2006,189(1):201-203．

[4]SittipuntC．Paraquatpoisoning[J]．RespirCare,2005,50(3):383-385．

[5] 祁存芳,張軍峰,張新林,等．紅景天苷通過抑制凋亡相關蛋白的表達保護缺氧對培養神經干細胞的損傷[J]．南方醫科大學學報,2010,33 (7):962-966．

[6]Liu Z,Li X,Simoneau A R,et al．Rhodiola rosea extracts andsalidroside decrease the growth of bladder cancer cell lines via inhibition of the mTOR pathway and induction of autophagy[J]．Mol Carcinog,2012,51(3):257-267．

[7]Mao G X,Wang Y,Qiu Q,et al．Salidroside protects human fibroblast cells from premature senescence induced by H(2)O(2) partly through modulating oxidative status[J]．Mech Ageing Dev，2010,131(11-12):723-731．

[8]Ouyang J,Gao Z,Ren Z,et al．Synergistic effects of rMSCs and salidroside on the experimental hepatic fibrosis[J]．Pharmazie, 2010,65(8):607-613．

[9]Guan S,Xiong Y,Song B,et al．Protective effects of salidroside from Rhodiola rosea on LPS-induced acute lung injury in mice [J]．Immunopharmacol Immunotoxicol,2012,34(4):667-672．

[10] 張卓一,陸如鳳,黃小民,等．紅景天苷對百草枯中毒大鼠肺組織Toll樣受體4和核轉錄因子-κB表達的影響[J]．中華中醫藥學刊,2014,32 (6):1357-1360．

[11]Hoet P H,Lewis C P,Demedts M,et al．Putrescine and paraquat uptake in human lung slices and isolated II type pneumocytes [J]．Biochemical Pharmacology,1994,48(3):517-524．

[12]Yamashita M,Ando Y．A long-term follow-up of lung function in survivors of paraquat poisoning[J]．Human&Experimental Toxicology,2000,19(2):99-103．

[13]Liu F,Liu H,Peng Y,et al．Inhibition of TGF-beta1 expression in human peritoneal mesothelial cells by pcDU6 vector-mediated TGF-beta1 shRNA[J]．Nephrology(Carlton),2006,11(1):23-28．

[14] 梁小慶,謝培,張勇,等．紅景天苷對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響[J]．中國天然藥物,2010,8(2):127-131．

[15] 菅向東,隋宏,楚中華,等．急性百草枯中毒血清細胞因子的動態變化[J]．中華勞動衛生職業病雜志,2007,25(4):230-231．

[16]Liu Z,Li X,Simoneau A R,et al．Rhodiola rosea extracts and salidroside decrease the growth of bladder cancer cell lines via inhibition of the mTOR pathway and induction of autophagy[J]．Mol Carcinog,2012,1(3):257-267．

[17]王媛媛,王慶,楊文海,等．紅景天對肺纖維化大鼠MMP-2與TIMP-1表達關系的影響[J]．重慶醫科大學學報,2010,35(5):689-691．

Protective effect of salidroside on paraquat poisoned rat lung tissue and its mechanism

Objective To investigate the effect of salidroside(SDS)on paraquat poisoned rat lung tissue and its mechanism．MethodsNinety Sprague-Dawley(SD)rats were randomly divided into normal control group (n=10),paraquat model group(n=40)and SDS treatment group(n=40)．Rats in model and treatment groups were administered with a single dose of PQ (1ml/kg)by gavage;then 1ml/kg salidroside (treatment group)or 0．9%saline(model group)was injected intraperitoneally．The rats in model and treatment groups were sacrificed at 1,6,24 and 72h after treatment(10 in a batch),the blood samples were taken from femoral arterial and the lung tissue samples were also collected．The serum IL-6 levels were measured,and the pathological changes in lung tissue were examined;the expression of TGF-β protein and mRNA were detected by immunohistochemistry and RT-PCR,respectively;the TNF-a levels in lung tissue were also measured．ResultsSevere hemorrhage and necrosis were noticed pathologically in lung tissue of model group,the degree of lung injury in treated group was attenuated compared with model group．Compared with normal control group,the expression on TGF-β1 in lung issue of both model and treatment groups at 6,24,72h increased significantly (all P＜0．01),but the expression in treatment group was lower than that in model group(P＜0．05)．The TGF-β1mRNA level in lung tissue of model and treatment groups began to increase at 1h after poisoning,but the level in treatment group was lower than that in model group (P＜0．05)．Compared with normal control group,lung tissue TNF-a levels and serum IL-6 levels of model and treatment groups began to increase from 6h after poisoning (P＜0．01), but those in treatment group were lower at each time points (all P＜0．05)．ConclusionSalidroside can attenuate the lung tissue injury induced by paraquat in rats,which is associated with down-regulation of TGF-β1,TNF-a expression in lung tissue and decreased serum IL-6 levels．

Salidroside Paraquat poisoning Acute lung injury Transforming growth factor-β1

2014-03-17）

（本文編輯：嚴瑋雯）

浙江省中醫藥科技計劃（2013ZA056）；浙江省醫藥衛生科技計劃（2013KYA141）

310006 杭州，浙江中醫藥大學附屬第一醫院急診科

張卓一，E-mail：zhangzhuoyi701213@163.com