抑制消減雜交技術(shù)在鯉魚抗寒研究中的應(yīng)用

鯉魚屬于變溫生物，其對外界環(huán)境溫度較為敏感，外界環(huán)境對其生長有重要影響。在低溫環(huán)境下，一些源于熱帶的魚類，如羅非魚、鯪魚等對環(huán)境溫度非常敏感，在溫帶以北地區(qū)的水域根本無法安全越冬。隨著生物學(xué)、生態(tài)學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，對于魚類如何適應(yīng)外界環(huán)境的研究成果越來越多。本文以鯉魚的抗寒研究為例，分析抑制消減雜交技術(shù)的應(yīng)用。

1 概述

抑制消減雜交技術(shù)（SSH）是由Diatchenko 等于1996年發(fā)明的一種以信使RNA差別顯示技術(shù)為基礎(chǔ)建立起來的篩選未知差異表達(dá)基因的新技術(shù)，主要基于新出現(xiàn)的抑制PCR，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)化和消減雜交。通過含引物序列的雙鏈接頭作為引物模板，使兩端接上同一接頭的非目的雙鏈片段具有反向末端重復(fù)序列，達(dá)到抑制非目的片段的目的。標(biāo)準(zhǔn)化平衡目的基因群中cDNA的豐度，消減雜交扣除目的基因群和驅(qū)趕基因群間的同源序列。

2 實驗材料與方法

2.1 材料

本實驗以某適合北方池塘養(yǎng)殖的抗寒類鯉魚為研究對象，這些鯉魚大小相差較小，在55～70克之間，且沒有病害。該抗寒鯉魚是雜交類鯉魚，能長期在低溫環(huán)境下生存。

2.2 方法

降溫實驗。將50尾健康的抗寒鯉魚放入到室內(nèi)控溫水族箱中，溫度為16℃，維持1天，然后在第二天早上8時進(jìn)行一次采樣，隨機(jī)采5尾魚提取肝臟、腦、肌肉等組織，并保存于液氮中。然后開始降溫，以1℃/小時的速度降溫，當(dāng)溫度降到10℃時，采5尾魚的肝臟、腦、肌肉組織，并保存在液氮中，而剩下的40尾魚繼續(xù)在10℃的環(huán)境中生存，到第二天，再抽取五尾魚的肝臟、腦、肌肉組織，依次類推，直到最后一天魚全部采完。然后將水族箱的溫度提高到16℃，開始第二階段的降溫實驗。挑選40尾魚放入到16℃的水族箱中，維持1天。在第二天早上8時開始降溫，直到降到10℃停止。到第二天早上8時開始，從10℃逐漸降到4℃，降溫速度與第一階段相同。到4℃后，每天采5尾魚進(jìn)行實驗，直到采完為止。

總RNA的提取。選擇10℃和4℃時采的5尾魚的腦組織樣品為研究對象，將樣品放入Trizol Reagent中，高速上下?lián)u勻，直到看不見組織和細(xì)胞碎片。在室溫環(huán)境下培育10分鐘，接著加入適量的氯仿，劇烈震蕩15秒，在室溫下培育3分鐘。4℃，在12 000轉(zhuǎn)/分下離心15分鐘，將上面的清液轉(zhuǎn)移到另一個離心管中，并加入適量的異丙醇，混勻后靜置10分鐘。4℃，在12 000轉(zhuǎn)/分下離心10分鐘，去上清，加入適量的75%乙醇并混勻。4℃，在7 500轉(zhuǎn)/分下離心5分鐘，去上清，在空氣中干燥，加入適量的DEPC-WATER，溶解沉淀，取少量的RNA，利用分光光度計檢測其純度和完整度，并置于零下80℃的冰箱中保存。

雜交。對每一個實驗樣品均進(jìn)行消減雜交，將cDNA、雜交緩沖液、連有接頭1的testerl-1和連有接頭2的testerl-2合并到一盒0.5毫升的離心管中，并將其置于PCR儀上，在98℃下放置1分鐘，接著將樣品放置在68℃的環(huán)境下培育8小時，并進(jìn)行下一步的雜交。將第一步雜交得到的兩個樣品混合到一起變成新的變性driver cDNA，將其與雜交緩沖液和去離子水混合到一起，并取出1微升的混合物到0.5毫升的離心管中，置于PCR儀上90℃變性90秒，然后將變性的driver cDNA取出，并將微量移液器調(diào)至15微升界面，小心的吸出所有的樣品。將槍尖移出液面，吸入少量的空氣，并在樣品的下方形成氣泡，接著重復(fù)前面的步驟，從管中取出新變性的driver，并將混合物轉(zhuǎn)移到含有雜交樣品1的管中，并進(jìn)行離心，在68℃下過夜培育，然后往管中加入稀釋液，搖勻，在PCR儀上68℃加熱7分鐘，最后儲存到零下20℃的冰箱中。

實驗結(jié)果。在鯉魚的生命中，某種特定類型的細(xì)胞只有比例約為10%～15%的基因表達(dá)，這些基因的特異性使得鯉魚從受精卵到生命機(jī)體死亡的全過程，故而其時空表達(dá)受到嚴(yán)格限制，在不同的發(fā)育狀態(tài)，基因表現(xiàn)出不同的特點。自SSH技術(shù)被發(fā)明出來，其就因強(qiáng)特異性、低假陽性率、高敏感性、高消減效率而被廣泛應(yīng)用，在魚類的基因克隆上也有應(yīng)用。在鯉魚抗寒研究中，其涉及到鯉魚的神經(jīng)調(diào)控系統(tǒng)、酶系統(tǒng)、生理調(diào)節(jié)系統(tǒng)等，抗寒類鯉魚的基因表達(dá)呈現(xiàn)出上調(diào)特點，這說明運用SSH技術(shù)進(jìn)行鯉魚的抗寒研究是可行。