雞傳染性法氏囊病的診斷

摘要：本文通過對東海縣八例疑似雞傳染性法氏囊感染病例的流行病學資料分析，臨床癥狀，剖檢病理變化進行的觀察，臨診診斷為傳染性法氏囊病毒感染。收集病料送實驗室進行診斷，通過瓊脂凝膠沉淀實驗和RT-PCR實驗，其中六例為誤診，兩例確診為雞傳染性法氏囊病。

關(guān)鍵詞：雞；傳染性法氏囊病；診斷與防治

雞傳染性法氏囊病是雞的一種急性、高度接觸性傳染病，該病發(fā)病突然、病程短，主要是腹瀉、顫抖、極度虛弱為癥狀。法氏囊水腫和腎臟腫脹，腿肌和胸肌出血、腺胃和肌胃交界處條狀出血是IBD特征性的病變。

1 材料

病料。采自東海縣某養(yǎng)殖場（戶）發(fā)病雞。

試劑。蒸餾水、氯化鈉（國藥集團化學試劑有限公司），瓊脂粉（國藥集團化學試劑有限公司），已知標準卵黃抗體（實驗室提供）；Taq DNA 聚合酶、dNTP購自上海華美生物工程公司，AMV購自Promega公司，Agarose為西班牙產(chǎn)品，100bp DNA Marker、200bp DNA Marker購自TaKaRa公司（大連），Trizol 為Invitrogen公司產(chǎn)品，DEPC購自BBI公司；其余常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

主要儀器。恒溫箱（上海科學醫(yī)器有限公司），高壓鍋（Tomy公司），打孔器、濕盒、平皿、離心機（上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠），PCR儀（2700型）為美國ABI公司產(chǎn)品，Bio-Rad-3000X1型電泳儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品，純水儀為Millipore公司產(chǎn)品，UV-2000紫外分析儀為Kodak公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 病例調(diào)查及臨床癥狀

病例一。東海縣雙店鎮(zhèn)前雙村王某于2014年4月上旬購進當?shù)夭蓦u150只進行圈養(yǎng)至40日齡時，發(fā)現(xiàn)雞精神不振、食欲差、腹瀉、發(fā)病雞有44只，發(fā)病率36.6%，1天內(nèi)死亡28只，死亡率18.6%。縣獸醫(yī)站門診獸醫(yī)通過詢問王某得知，雞群在飼養(yǎng)期間分別在8日齡和22日齡用新城疫IV系苗飲水進行第二次免疫外，未做其他免疫。

病例二。東海縣石榴鎮(zhèn)蔣習村姜某2014年4月中旬購進蛋雞500只圈養(yǎng)，飼養(yǎng)至42日齡時，雞突然發(fā)病，精神不振，排出白色稀糞，發(fā)病雞有70多只，發(fā)病率為14%，2天內(nèi)共死亡48只，死亡率為9.6%。死亡之速度快，死亡率高，縣獸醫(yī)站門診獸醫(yī)通過了解姜某得知，雞群在飼養(yǎng)期間7日齡和14日齡分別用新城疫支氣管炎H120和中等毒力法氏囊苗飲水免疫兩次，未做其他免疫。

病例三。東海縣牛山鎮(zhèn)張莊村張某2014年5月上旬購進當?shù)夭蓦u100只飼養(yǎng)，飼養(yǎng)至46日齡時雞突然發(fā)病。有三分之一只雞精神不振，排出黃白或黃綠色稀糞，發(fā)病率為35%。由于張某就診及時，病雞死亡數(shù)量不大，死亡率約9%，門診醫(yī)生通過了解張某得知，雞在飼養(yǎng)期間未用過任何疫苗免疫。

病例四。東海縣牛山鎮(zhèn)河塘村養(yǎng)雞戶盧某2014年5月上旬購蛋雞4 000多只圈養(yǎng)，飼養(yǎng)至58日齡時，雞群突然發(fā)病、腹瀉、精神不振、發(fā)病雞大約有三分之一，發(fā)病率為34%，2天內(nèi)死亡460多只，死亡率11.5%。通過向王某了解得知，該雞群在飼養(yǎng)期間于7日齡和21日齡分別用新城疫支氣管炎H120和新城疫IV免疫兩次，在14日齡和28日齡用中等毒力法氏囊苗免疫兩次，其他未做免疫。

病例五。東海縣青湖鎮(zhèn)青南村李某在2014年5月中旬購肉雞300只，飼養(yǎng)至37日齡時，雞突然發(fā)病，發(fā)病雞有150多只，發(fā)病率達50%，排白色綠色稀糞，死亡率46%。門診醫(yī)生詢問戶主得知，飼養(yǎng)期間在7日齡和14日齡時分別使用新城疫支氣管炎H120和中等毒力法氏囊苗飲水免疫兩次，另外未做其它免疫。

病例六。東海縣石榴鎮(zhèn)馬圩村陳某在2014年5月中旬購當?shù)夭蓦u400只，飼養(yǎng)至46日齡時，雞突然發(fā)病，精神沉郁，食欲減少，排出黃白色或黃綠色稀糞，發(fā)病雞有200余只，發(fā)病率為50%，死亡率達15%，門診醫(yī)生詢問陳某得知，此雞群飼養(yǎng)期間在7日齡和22日齡時用新城疫IV系苗飲水免疫兩次，另外未做其它免疫。

病例七。東海縣曲陽鄉(xiāng)曹莊村曹某在2014年4月下旬購肉雞800只，飼養(yǎng)至45日齡時，該雞群有300余只雞發(fā)病，發(fā)病率達37.5%，死亡率達20%，該雞發(fā)病突然，死亡速度快，排出白色稀糞。門診醫(yī)生詢問得知，此雞群在飼養(yǎng)期間8日齡和23日齡分別用新城疫支氣管炎H120和新城疫IV飲水免疫兩次，另外未做其他免疫。

病例八。東海縣牛山鎮(zhèn)鄭莊村鄭某在2014年4月下旬購草雞200只，飼養(yǎng)至58天時，該雞群有1/2的雞發(fā)病突然，發(fā)病率達50%，死亡率為18%，該雞據(jù)鄭某講在自己院子里養(yǎng)，飼養(yǎng)期間未使用過任何疫苗。

2.2 剖檢變化

病例一。剖檢可見病雞法氏囊腫大，疑為雞傳染性法氏囊病（IBD）。

病例二。剖檢可見病雞法氏囊腫大，小腸有出血點，疑為雞IBD。

病例三。剖檢可見胸肌和腿肌線狀出血，法氏囊水腫并且出血，疑為IBD。

病例四。剖檢可見心臟有出血點，法氏囊腫大，腎臟無明顯變化，疑為雞IBD。

病例五。剖檢可見法氏囊腫大出血，腎臟腫大，腺胃和肌胃交界處有條狀出血點，疑為IBD。

病例六。剖檢可見法氏囊腫大，疑為雞IBD。

病例七。剖檢可見法氏囊腫大，疑為雞IBD。

病例八。剖檢可見法氏囊腫大，出血，疑為雞IBD。

2.3 瓊脂凝膠沉淀實驗

取病死雞的法氏囊，經(jīng)過剪碎研磨，按1∶5的量加入雙抗磷酸鹽緩沖液混勻，分裝于指形管中，置零下20℃?zhèn)溆谩?/p>

瓊脂板的制備。用8%氯化鈉、1%瓊脂粉、100毫升蒸餾水混合，121℃條件下15分鐘高壓后制成瓊脂溶液，倒入平皿中，厚度為3～4毫米[1]。

打孔和加樣。把事先制好打孔的圖案放在瓊脂板下面，用打孔器在瓊脂平板上打孔，并挑去孔內(nèi)瓊脂，然后封底，孔徑為3毫米，孔與孔之間為4毫米，中央孔加標準抗體，將1號待檢抗原分別加入到1、2孔中，將2號待檢抗原分別加入到3、4孔中……將8號待檢抗原加到15、16孔中，加抗原、抗體時，以加滿不溢出為度，將加完樣的瓊脂平板加蓋后，在室溫靜置片刻，待抗原稍微擴散而液面下陷后，平放于帶蓋的濕盒中，置于37℃的溫箱中，于24小時觀察并記錄結(jié)果[2]。

2.4 RT-PCR實驗

引物設計。參考OIE上已發(fā)表引物，序列如下。

上游引物。5'-TGT-AAA-ACG-ACG-GCC-AGT-

GCA-TGC-GGT-ATG-TGA-GGC-TTG-GTG-AC-3′

下游引物。5'-CAG-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-

GAA-TTC-GAT-CCT-GTT-GCC-ACT-CTT-TC-3'引物Upper U3、Lower L3為擴增IBDV的特異性引物，擴增片段為604bp，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成，工作濃度為25微摩/升[3]。

病毒RNA的提取。取病料懸液進行差速離心，先用3 000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，再6 000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，取上清250微升，加TRIZOL 400微升，上下顛倒混勻，置室溫作用5～10分鐘，加400微升氯仿，劇烈震蕩，使充分混勻[4]。12 000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，小心吸取上清300微升，加冰預冷的異丙醇，600微升/管，顛倒混勻，零下20℃放置10分鐘，12 000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘（此時可見半透明的RNA貼與管底），棄上清，每管加入70%乙醇（用DEPC水配制）1 000微升，充分潤洗指形管，12 000轉(zhuǎn)/分離心2分鐘，棄上清，置超凈臺將余下的酒精吹干，加20微升DEPC處理水，70℃水浴溶解10分鐘[5]。

反轉(zhuǎn)錄cDNA的合成。加入20%DMSO，混勻，沸水中煮5分鐘，然后迅速置冰盒中，使之冷卻。25微升反轉(zhuǎn)錄體系包括反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液2.5微升，反轉(zhuǎn)錄酶1微升，RNA酶抑制劑0.5微升，模板5微升，反轉(zhuǎn)錄引物0.5微升，dNTP 2微升，添加超純水至總體積25微升，混勻，置42℃水浴1小時[6]。取4微升cDNA為模板，加入合成的特異性引物各0.5微升，其他成分如下：10×buffer5 微升，10毫摩/升 dNTP1微升，TapDNA聚合酶0.5微升，加超純水至總體積50微升。反應條件為95℃預變性5分鐘，95℃變性30秒，64℃退火45秒，72℃延伸60秒，35個循環(huán)。72℃再延伸5分鐘，4℃保存。取20微升PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

3 結(jié)果

3.1 瓊脂擴散試驗結(jié)果

在標準卵黃抗體與1號、2號、4號、6號、7號、8號被檢樣之間沒有出現(xiàn)沉淀線，呈現(xiàn)陰性反應。標準卵黃抗體與3號、5號被檢樣之間出現(xiàn)了沉淀線，其中5號被檢樣沉淀線色較淡，呈現(xiàn)陽性反應，確定3號、5號病例為IBD。

3.2 RT-PCR結(jié)果

泳道1為1號樣品RT-PCR產(chǎn)物，泳道2為2號樣品RT-PCR產(chǎn)物……泳道8為8號樣品RT-PCR產(chǎn)物，泳道9為200bp DNA Ladder Marker。

結(jié)果第三、五例病例通過RT-PCR擴增處出現(xiàn)特異性條帶，其余病例沒有特異性條帶。

3.3 結(jié)論

根據(jù)本次流行的發(fā)病情況，臨床表現(xiàn)，病理剖檢變化和瓊擴、RT-PCR實驗診斷，確診病例三和病例五為雞IBD。本次流行和未使用法氏囊疫苗有直接關(guān)系，其次是消毒制度不規(guī)范，疫苗選擇、使用不當，免疫程序不合理是造成發(fā)病的另一個原因。

4 防制措施

4.1 病原和傳播途徑的控制

科學選址，改進布局，加強飼養(yǎng)管理，堅持全進全出制。新建雞場或有條件擴大飼養(yǎng)規(guī)模的雞場，無論是場址的選擇、布局或是日常管理都應引起足夠的重視。雞場選址應做到地勢高燥，水源充足，土壤基質(zhì)好，環(huán)境幽靜的地方。選址受到限制的專業(yè)戶，要盡量不與其他畜禽混養(yǎng)，并采取適當?shù)母綦x措施。在管理方面按照不同日齡要求調(diào)整雞舍溫度和濕度，及時通風，保證營養(yǎng)要求和充足飲水，每天定時清糞，無關(guān)人員不得進入雞舍等，并做到每星期一次定期消毒。把不同日齡的雞分開飼養(yǎng)，嚴禁放在同一雞舍飼養(yǎng)，最好做到全進全出。

4.2 易感雞群的控制

合理的免疫程序和使用安全有效的疫苗，減少易感雞群的數(shù)量。選擇適宜的IBD疫苗，針對性的制定免疫程序和免疫途徑，是防制IBD疫病的流行的有效措施。

依據(jù)母源抗體水平確定首免日齡，東海縣地區(qū)首免日齡一般是雛雞14日齡時用中等毒力活疫苗，滴鼻和飲水口服，28日齡再加強一次。

4.3 發(fā)病雞群及時采取控制措施，病死雞合理處理

對于發(fā)病雞群，應以控制疫情擴散為中心，主要采取隔離、消毒和藥物防治等措施。

發(fā)現(xiàn)雞群發(fā)生IBD疑似病例，應立即實施隔離，把疑似病雞排出置于隔離區(qū)，徹底消毒，同時應加強飼養(yǎng)管理，補充多維素和電解質(zhì)以增強機體的抗病能力。

參考文獻：

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