響應面法優化馬奶酒發酵條件的研究

王 璐，李小溪，古麗娜孜，張晨璐，張 藝，段莉薇，閻曉菲，武 運*

（1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆農業大學 科學技術學院，新疆 烏魯木齊 830052）

馬奶是新疆少數民族飲食文化中的瑰寶，至今仍保留著馬奶酒的傳統制作方法。馬奶的營養價值很高，含有豐富的蛋白質、乳糖、維生素和礦物質，并含有人體不可缺少的氨基酸和脂肪酸[1]。草原鮮馬奶雜質少，用其釀出的馬奶酒所含甲醇、異丁醇、異戊醇成分極低，鉛、汞等重金屬含量低于國家標準的10%，甲醛的含量更是少之又少。此外，馬奶酒的營養價值也很高，氨基酸的總量比新鮮馬奶高約51%[2-4]。

目前，有部分關于奶酒發酵條件優化的研究[5-8]，但采用響應面法優化馬奶酒發酵條件的文章較少，針對以上現狀，為充分開發利用新疆馬奶資源，提高馬奶綜合經濟效益，本試驗主要以新疆烏魯木齊南山地區新鮮馬奶為原料，通過單因素試驗確定馬奶酒發酵工藝，采用響應面法優化馬奶酒發酵條件的最佳參數，為新疆新鮮馬奶的工業化生產和利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮馬奶：新疆烏魯木齊南山地區。

乳酸菌、酵母菌：新疆農業大學食品科學與藥學學院微生物實驗室。

MRS培養基：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸二胺2g，磷酸氫二鉀2g，乙酸鈉5g，硫酸鎂0.58g，硫酸錳0.25g，吐溫-80 1mL，蒸餾水1000mL。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL。

1.2 儀器與設備

MST-401 JM10002型電子秤：上海民橋精密科學儀器有限公司；LD2X-50KB型立式電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器廠；DZKW-172電熱恒溫水浴鍋：北京市光明醫療儀器廠；CH2176J微電腦電磁爐：中山市格蘭仕生活電器制造有限公司；SXKW數顯控溫電熱套：北京市永光明醫療儀器廠；HR40-ⅡA2生物安全柜：青島海爾特種電器有限公司；WFI-J型手持測糖儀：成都豪創光電儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 馬奶酒加工工藝流程

新鮮馬奶→過濾→殺菌→冷卻→接種乳酸菌和酵母菌→酒精發酵→灌裝→成品

1.3.2 分析測定方法

酒精度測定：用酒精計進行測定；酸度測定：用酸堿滴定法進行測定；還原糖測定：用糖度計進行測定。理化、衛生指標測定：參考GB/T 23546—2009《奶酒》[9]。

感官指標：采用綜合評分法，在有明亮自然光、溫度為25℃的房間內進行馬奶酒感官評定。感官評分標準（滿分100分）見表1。

表1 馬奶酒感官評分標準Table 1 Sensory evaluation criteria of Kumiss

1.3.3 操作要點

（1）馬奶的預處理

原料奶需無添加劑、無異味的新鮮馬奶，用4層紗布過濾將馬奶中的雜質和異物除去。再將馬奶加熱至90～95℃，保持30s殺菌，放置冷卻至室溫，待發酵用。

（2）種子發酵液及母發酵液的制備

種子發酵液：將4℃保存的乳酸菌與酵母菌菌種在無菌環境下接種于MRS、YPD培養基中活化，分別置于37℃培養24h、28℃培養48h，以備后期使用[10]。

母發酵液：將預處理好的馬奶分裝于三角瓶中，在無菌條件下，將已活化好的乳酸菌與酵母菌種子發酵液按5%接種量接入三角瓶中，搖勻，分別置于37℃培養24h、28℃培養48h。

1.3.4 馬奶酒發酵條件優化

（1）單因素試驗

分別選取接菌量（乳酸菌/酵母菌）為2%∶6%、3%∶5%、4%∶4%、5%∶3%、6%∶2%，發酵溫度為26℃、28℃、30℃、32℃、34℃，發酵時間為24h、48h、72h、96h、120h，糖添加量為4%、6%、8%、10%、12%；進行單因素發酵試驗，通過測定酒精度、酸度、糖度以及感官評分進行單因素考察。

（2）響應曲面設計優化試驗

在單因素試驗結果基礎上，根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理分別對影響酒精度（Y）的3個因素：接菌量（乳酸菌/酵母菌）（A）、發酵時間（B）、發酵溫度（C），利用響應面軟件Design-Expert 8.05軟件，根據Box-Behnken試驗組合設計進行3因素3水平試驗。響應面試驗的因素和水平編碼值見表2。

表2 響應面試驗的因素和水平編碼值Table 2 Factors and levels of response surface methodology

2 結果與分析

2.1 影響馬奶酒發酵的單因素試驗

2.1.1 不同接菌量對發酵的影響

表3 不同接菌量對發酵的影響Table 3 Effect of different inoculum on fermentation

酵母菌的含量是影響酒精發酵的重要因素之一[11]。由表3可知，當酵母菌所占的比例較少時，馬奶酒的酒精含量較低。酒精積累量隨添加酵母菌比例的增大而升高，當接菌量（乳酸菌%/酵母菌%）比例為3%∶5%，酸馬奶酒的酒精含量最高，糖度與酸度均較低，說明大量的糖與酸都轉化成了酒精，并且與感官評價結果相符合，因此選擇接菌量（乳酸菌%/酵母菌%）比例3%∶5%最為合適。

2.1.2 不同發酵溫度對發酵的影響

表4 不同發酵溫度對發酵的影響Table 4 Effect of different temperature on fermentation

發酵溫度對菌體的生長繁殖有很大的影響，只有在適宜的溫度范圍內才能生長并起發酵作用。據文獻報道[12]，發酵溫度是影響果酒風味的主要因素。由表4可知，當溫度為30℃時，馬奶酒酒精含量達到最高為1.2%vol，但當發酵溫度過高超過30℃時，酵母的繁殖和發酵能力反而下降，酒精的積累也逐漸減少，感官評價得分最高的也是在發酵溫度為30℃時獲得，因此選擇30℃為最為最佳發酵溫度。

表5 不同發酵時間對發酵的影響Table 5 Effect of different time on fermentation

2.1.3 不同發酵時間對發酵的影響

隨著發酵時間的延長，酵母菌充分生長，酒精度也逐漸升高。由表5可知，當發酵時間為72h時是個拐點，24～72h間馬奶酒的酒精含量逐漸升高，當發酵時間在72～120h時，馬奶酒的酒精積累量明顯降低，結合感官評價發酵72h的馬奶酒分數最高為83，說明馬奶酒的甜度、酸度、酒精度適中，口感較好，因此選擇發酵時間為72h。

2.1.4 不同糖添加量對發酵的影響

表6 不同糖添加量對發酵的影響Table 6 Effect of different sugar addition on fermentation

菌株的發酵能力在一定范圍內隨著碳源的增加而增強，添加蔗糖為酵母菌和乳酸菌提供了豐富的碳源，增強了菌株的發酵能力，使得馬奶酒的酒精含量、糖度、酸度都高于前幾組單因素試驗結果。由表6可知，加糖量在4%～8%時，酒精度積累量逐漸增加，但當加糖量超過8%時，發酵能力平緩并有下降的趨勢，可能是因為添加蔗糖含量過高，馬乳中的糖濃度過高，抑制了酵母菌和乳酸菌的生長，從而使得酒精度下降，糖度和酸度較高。感官評價結果顯示添加糖含量為6%時，馬奶酒的口感較好。因此，綜合以上原因選擇加糖量為6%最為恰當。

2.2 馬奶酒發酵響應面優化分析

綜合單因素試驗結果，選取對酒精發酵影響較大的3個因素（接菌量、發酵時間、發酵溫度）作為響應因素，采用Box-Behnken Design響應面分析法對其進行優化。響應面試驗設計及響應值結果見表7。

按照表7試驗數據進行多元回歸方程擬合，以馬奶酒酒精度（Y）為響應值可建立以馬奶酒酒精度對接菌量（A）、發酵時間（B）、發酵溫度（C）的擬合方程：

表7 響應面試驗設計及結果Table 7 Experimental design and result of response surface methodology

表8 響應面試驗結果及方差分析Table 8 Variance analysis of response surface experiment results

回歸方程中各變量對指標（響應值）影響的顯著性，由F檢驗來判定，概率P的值越小，則相應變量的顯著程度越高[13-15]。由表8可知，當模型F=68.44時，P＜0.000 1，說明模型是極顯著的。當失擬項F=1.12時，P=0.440 4＞0.05，說明模型失擬項不顯著。決定系數R2=0.988 8，校正系數R2Adj=0.974 2，表明酒精度的實測值與預測值之間具有很好的擬合度，由此可以說明模型的建立呈顯著性，試驗操作準確可信，因此可以利用此模型對馬奶酒發酵過程進行分析和預測。

從表8可知，一次項與二次項均對馬奶酒的Y值影響表現出極顯著水平，交互項AB、AC對馬奶酒Y值的影響表現為顯著水平，交互項BC對馬奶酒Y值的影響不具有顯著水平的影響。試驗結果可以得出各因素對馬奶酒酒精度的影響A＞C＞B，即接種量比例＞發酵溫度＞發酵時間。

2.3 響應面圖與等高線圖分析

為了考察各個交互項對馬奶酒酒精度的影響，在其他因素固定不變的情況下，利用Design-Expert 8.05軟件對回歸方程進行運算，作出交互項的三維響應面圖及等高線圖，能比較直觀的解釋各個變量和變量之間對響應值的影響。

圖1 各因素相互作用對馬奶酒酒精發酵影響的響應面圖與等高線圖Fig.1 Response surface plot and contour plot of interaction among each two factors of inoculums,fermentation temperature and time on Kumiss fermentation

由圖1可以看出，隨著接菌量比例的變化，酒精度呈先上升后下降的趨勢，發酵時間對馬奶酒酒精度影響不明顯，其曲線表現較為平滑，發酵時間與接種量比例之間的交互作用不顯著；酒精度隨發酵溫度及接菌量比例的升高呈先上升后下降的趨勢，發酵溫度及接菌量比例的交互作用顯著；隨著發酵溫度的升高，酒精度呈先上升后降低的趨勢，發酵時間與發酵溫度的交互作用不顯著。

2.4 馬奶酒發酵條件優化驗證試驗

對馬奶酒酒精度取最大值，由軟件自動分析可得到馬奶酒最佳發酵條件理論值為：接菌量（乳酸菌/酵母菌）2.8%∶5.2%、發酵時間80.8h、發酵溫度31.68℃，所測酒精度為6.967 82%vol。考慮實際操作方便，選取接菌量（乳酸菌%/酵母菌%）3%∶5%、發酵時間80h、發酵溫度32℃，進行3次平行試驗，馬奶酒的酒精度為7.0%vol、6.9%vol和7.0%vol，說明該數學模型的建立對馬奶酒酒精度的預測比較準確。

2.5 產品質量指標

2.5.1 感官指標

外觀：酒體乳黃色，有少量蛋白沉淀；香氣：具有純正的乳香，淡淡的酒香；滋味：酒體醇厚，酒香柔和，酸甜協調，無異味；具有本品典型風格。

2.5.2 理化指標

酒精度3%vol～8%vol；總酸（以檸檬酸計）4～8g/L；還原糖（以葡萄糖計）40.1～70.0g/L。

2.5.3 微生物指標菌落總數：1個/mL；大腸桿菌：1個/100mL；致病菌：未檢出。

3 結論

在單因素試驗的基礎上，利用響應面軟件，通過接菌量（乳酸菌：酵母菌）、發酵溫度、發酵時間3個因素，以馬奶酒酒精度為響應值進行模型建立和模型預測，得出馬奶酒最佳發酵條件分別為接種量（乳酸菌/酵母菌）3%∶5%，發酵溫度32℃，發酵時間80h，糖添加量6%。在此條件下發酵的馬奶酒酒精度平均為7.0%vol，說明該數學模型對優化馬奶酒發酵條件可行，并為馬奶酒工業化成產提供了依據，具有一定的實用意義。

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