野木瓜提取液的抗氧化活性研究

崔霖蕓

（遵義醫藥高等?？茖W校基礎部，貴州 遵義 563003）

自由基是含有一個或多個不對稱電子的原子、分子或離子。正常條件下，生物體內僅1%～4%的O2產生超氧陰離子（O2－·）和羥自由基（·OH），但當線粒體的結構與功能受影響時，自由基產生增多[1]。自由基具有很強的氧化能力，若其數量超過機體的清除能力時便會對機體產生損傷，會直接或間接地降低酶活性，促使多糖降解、DNA 鏈斷裂，從而引起體內代謝紊亂，導致各種疾病發生[2]。因此，清除自由基對維持健康、延緩衰老、防癌抗癌等方面均有積極的作用。天然植物中含有豐富的抗氧化性物質（如黃酮類化合物、多酚化合物、多糖化合物等）。研究顯示，物質的還原力與其抗氧化性間有顯著的正相關性，還原力的高低可反映抗氧化能力的強弱[3]，黃酮類化合物的分子結構中具有數量不等的酚羥基因而具有較強的還原性，是很有潛力的抗氧化劑[4-5]。多酚類化合物是極好的氫或電子供體，且不會引發新的游離基或由于鏈反應而被迅速氧化，具有很好的抗氧化效果[1]。多糖結構中的醇羥基可以與產生·OH等自由基所必需的金屬離子絡合，使羥自由基的產生受到抑制[2，6]，從而具有一定的抗氧化性。此外，皂苷類、鞣質類、褪黑素類、不飽和脂肪酸、礦物質等均有一定的抗氧化作用[1]。

野木瓜（Stauntonia chinensis）是木通科（Lardizabalaceae）野木瓜屬植物。貴州省正安縣于1996 被國務院發展研究中心等單位命名為“中國野木瓜之鄉”，其盛產的野木瓜以果大、皮薄、肉細、氣香、味甘酸等特點著稱[7]。中醫典籍記載其莖葉微苦，其果味甘、平，歸心、腎經[8]，具有舒筋活絡、解渴生津、平肝和胃、祛風止痛等功效。現代研究表明，野木瓜中含有豐富的皂苷和木脂素苷類化合物，還含有黃酮苷類化合物、酚性成分、多糖類化合物[9]。此外，野木瓜果實中含有豐富的有機酸、果膠、胡蘿卜素、黃酮類、氨基酸、多種維生素和多種礦物質等[10]，這些物質很多是天然的抗氧化劑。國內外對野木瓜的鎮痛抗炎、放射增敏及肝保護等方面的研究較多[11-12]，但對野木瓜提取物的抗氧化能力的研究卻很少。顯然，在人們日益關注自身保健的今天，若能發現野木瓜的抗氧化功效，將對開發其在保健、防癌抗癌方面的新用途具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮野木瓜果：購自貴州正安縣。

石油醚（化學純）：天津市永大化學試劑有限公司；無水乙醇、水揚酸、H2O2、HCl（化學純）：天津天大化學試劑廠；VC（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；鐵氫化鉀、三氯乙酸、FeCl3、鄰苯三酚（分析純）：西安三浦化學試劑有限公司；pH=6.6的磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖液（配制方法見文獻[13]）、pH=8.34的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液（配制方法見文獻[14]）。

1.2 儀器與設備

752N紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；SHZ-DⅢ型予華牌循環水真空泵：鞏義市予華儀器有限責任公司；BSA223型電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；RE-52A型旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；TL80-2型離心機：姜堰市天力醫療器械有限公司；DK-S26 型恒溫水浴鍋：上海森信實驗儀器有限公司；PHS-2F型精密酸度計：上海雷磁儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

將野木瓜鮮果洗凈→去籽囊切成2～5mm 薄片→50℃烘干→粉碎后過40 目篩→石油醚脫色回流至石油醚無色→抽濾，濾渣風干。

（1）準確稱取預處理后的野木瓜粉5g，置入250mL圓底燒瓶中，加入體積分數83%的乙醇151mL，在70℃回流浸提2h，抽濾，濾液在60℃減壓濃縮，最后定容至25mL，得野木瓜醇提物。

（2）準確稱取處理后的野木瓜粉5g，置入250mL圓底燒瓶中，加入蒸餾水151mL，在70℃回流浸提2h，抽濾，濾液在60℃減壓濃縮，最后定容至25mL，得野木瓜水提物。

表1 實驗取樣方案Table 1 Experimental design of sampling

1.3.2 野木瓜提取液還原力的測定[2，15-16]

試驗采用Oyaizu法，主要根據待取液能將Fe3+還原為Fe2+的多少來檢測其還原能力。取表1中的各組待試液，分別加入pH=6.6的磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖液5.0mL，加入1%（質量分數）鐵氫化鉀3.0mL，50℃水浴恒溫反應20min后急速冷卻，加入10%（質量分數）三氯乙酸3.0mL搖勻，于3000r/min離心10min，取上清液2.5mL，依次加入蒸餾水2.0mL，0.1%（質量分數）FeCl30.5mL，搖勻，靜置10min，在波長700nm處測吸光度值，吸光度值越大則還原力越強。

1.3.3 野木瓜提取液對羥基自由基（·OH）的清除率的測定[16-18]

采用Fenton法，其基本原理：在過渡金屬離子催化作用下，過氧化氫可發生均裂產生羥自由基（·OH），反應式為：

水楊酸捕獲·OH產生有色物質，通過測定吸光度值，可以得出·OH的多少，若加入具有清除·OH功能的待測液，便會與水楊酸競爭·OH，從而使反應生成的有色物質減少，由此可測定待測液對·OH的清除能力。

參照上述文獻方法，在19支25mL容量瓶中分別加入3.0mL 2mmol/L的FeSO4和3.0mL 6mmol/L的水楊酸，搖勻，加入表1中的各組待測液，最后向各容量瓶中分別加入3.0mL 2mmol/L的H2O2，搖勻后置入37℃水浴鍋中恒溫反應15min，取出在波長510nm處測吸光度值A，得到各待測液對·OH的清除率：

式中：A0為未加待測液（即加入4mL 蒸餾水）的吸光度值；Ax為加入各待測液后的吸光度值。

1.3.4 野木瓜提取液對超氧陰離子（O2－·）清除率的測定[16，19-20]

參考上述文獻的鄰苯三酚自氧化法，取pH=8.34的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖溶液4.7mL，加入4.0mL蒸餾水搖勻，加入3mmol/L的鄰苯三酚0.3mL（以10mmol/L的HCl配制，空白管用10mmol/L的HCl代替鄰苯三酚的HCl溶液），迅速搖勻倒入比色皿（1cm）中，在波長325nm處測吸光度值，每隔30s記錄1次，至4.5min止，將所測吸光度值與時間回歸，其斜率即為鄰苯三酚自氧化速率。

樣品清除超氧陰離子自由基的測定：操作方法同上，在加入鄰苯三酚前，先將4.0mL蒸餾水換成表1中的各組待測液，按上述方法測吸光度值，回歸求得加入待測液后的鄰苯三酚自氧化速率。

式中：V0為未加待測液（即加入蒸餾水）時鄰苯三酚自氧化速率；Vx為加入待測液后的鄰苯三酚自氧化速率。

2 結果與分析

2.1 野木瓜提取液還原力的測定

由圖1可見，隨著野木瓜提取液（或VC濃度）的增加，吸光度值剛開始迅速增加，當提取液的量增加至1.5mL（或VC濃度增加至0.3mg/mL）后，增長趨于平緩。吸光度值的大小反應了還原力的強弱，由圖1可知，還原力由強到弱依次為VC＞野木瓜醇提物＞野木瓜水提物。當加入野木瓜醇提物4mL時（相當于從0.8g野木瓜粉中提取的液量，換算過程為5g÷25mL×4mL=0.8g，參見1.3.1），其還原力只是略低于0.8mg/mL的VC的還原力，說明野木瓜提取物有較強的還原力。還原力與抗氧化性間顯著正相關，還原力的高低反映了抗氧化能力的強弱[21]。因此說明野木瓜提取液有較強的抗氧化能力。

圖1 野木瓜提取液的還原力Fig.1 Reducing power of S.chinensis extraction solution

2.2 野木瓜提取液對羥基自由基（·OH）的清除作用

圖2 野木瓜提取液對·OH的清除Fig.2 ·OH scavenging effects of the S.chinensis extraction solution

圖2是不同量的野木瓜提取液與不同濃度VC對·OH的清除作用的對比曲線。當加入野木瓜提取液的量較少時（或VC濃度較低時），對·OH的清除作用均較小，不到20%，隨著添加提取液量（或VC濃度）的增加，清除率迅速上升，其中VC的清除率上升最快，并迅速超過野木瓜提取液的清除能力，野木瓜兩種提取介質（乙醇和蒸餾水）的提取液對·OH的清除作用差別不明顯。當加入提取液的量超過2mL（或加入VC的質量濃度超過0.4mg/mL）后對·OH的清除作用增速趨于平緩。當加入4mL野木瓜提取液（相當于從0.8g野木瓜中提取的量），對·OH的清除率可達77.42%（水提物）和76.66%（醇提物），與0.246mg/mL VC的清除率79.26%幾乎相當（即加入4mL的0.8mg/mL VC的清除率，總反應液量為13mL（見1.3.3），因此，反應液中VC的質量濃度為0.246mg/mL，說明野木瓜提取液對·OH有很好的清除作用。

2.3 野木瓜提取液對超氧陰離子（O2－·）的清除作用

圖3 野木瓜提取液對清除Fig.3 scavenging effects of the S.chinensis extraction solution

圖3給出了不同量的野木瓜提取液與不同濃度VC對超氧陰離子（O－2·）的清除作用對比，野木瓜乙醇提取液對O－2·的清除作用明顯高于其水提取液，這可能是乙醇提取液中溶出了更多黃酮類化合物的原故。野木瓜醇提物對O－2·的清除作用與VC的作用幾乎相當，變化也相似。在加入醇提物的量較少（或VC濃度較低時），對O－2·的清除作用也較小，不到35%，但隨著量的增加，清除作用迅速增加，在超過2mL后（此時清除率達到87.42%）增速趨于緩和。當加入4mL提取液量（相當于從0.8g野木瓜粉中提取的液量），對O2－·的清除率可達到96.36%（乙醇提?。?，與0.356mg/mL的VC的清除率96.69%相當（此處即為加入4mL 0.8mg/mL的VC時的清除率，總反應液量為9mL（見1.3.4），因此，反應液中VC的質量濃度為0.356mg/mL），說明野木瓜乙醇提取液對O－2·有很好的清除作用。野木瓜水提取物對O－2·的清除作用稍小，但當加入液量為4mL時，也達到90.78%，說明野木瓜水提物對O－2·也有較好的清除作用。

3 結論

實驗證實野木瓜乙醇提取液的還原力高于其水提取液的還原力，但均略低于VC的還原力，但在清除羥基自由基（·OH）能力上，醇提物與水提物及一定濃度的VC大致相等，野木瓜乙醇提取物對超氧陰離子（O－2·）的清除力與VC相當，超過了96%，高于水提物的清除力。本實驗的不足在于，由于實驗條件及時間的局限，沒有對野木瓜提取液的成分進行定量分析，但據文獻報道可推測野木瓜的抗氧化性主要可能來源于野木瓜中的黃酮類化合物、多酚類化合物、多糖類化合物[1-6]。醇提物在總還原力和對超氧陰離子的清除力上均高于水提物，可能是由于醇提物中溶解了更多的黃酮和多酚類化合物（根據極性相似相溶原理），而水提物中溶解了更多的多糖類化合物，提高了水提物對羥自由基的清除作用（多糖類化合物對羥自由基有較好的清除作用[2，6]）。本研究從總體上證明了野木瓜有很好的抗氧化作用，是一種較好的天然抗氧化劑，因此，對推廣和開發野木瓜飲品、食品、保健藥品等具有一定的指導作用。

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