太空搭載木聚糖酶高產(chǎn)菌株的選育

趙子高，王林風(fēng)，閆德冉，楊付偉

（河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司，車用生物燃料技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽(yáng) 473000）

太空誘變育種又稱空間誘變育種，利用強(qiáng)輻射、微重力、高真空、弱磁場(chǎng)等宇宙空間特殊環(huán)境誘變因子的作用，使生物基因發(fā)生變異，再返回地面進(jìn)行選育，培育新品種[1-2]。近年來(lái)我國(guó)航天育種發(fā)展迅速，作微生態(tài)制劑的乳酸菌、產(chǎn)維生素C的生黑醋酸桿菌、產(chǎn)泰樂(lè)菌素的由弗氏鏈霉菌、產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶鏈霉菌、甘露聚糖酶產(chǎn)生菌、產(chǎn)超氧化物歧化酶的芽孢桿菌、產(chǎn)纖維素酶的里氏木霉菌等[3-8]經(jīng)空間誘變后均在一定程度上獲得了正突變株。研究將生產(chǎn)木聚糖酶的黑曲霉菌種搭載“神舟九號(hào)”宇宙飛船進(jìn)行空間誘變育種，以期獲得產(chǎn)酶能力大幅提高、性能穩(wěn)定的突變株，應(yīng)用于木聚糖酶的生產(chǎn)，降低纖維類原料在酶解過(guò)程物料黏度的同時(shí)促進(jìn)半纖維素分解生成木糖等酵母可利用單糖，提高原料利用率，降低纖維乙醇生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

黑曲霉菌株（Aspergillus niger）：由本研究室從生產(chǎn)中分離獲得，CGMCC保藏號(hào)TG-Y。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂1.8%。種子培養(yǎng)基：葡萄糖2%，麩皮1%。篩選培養(yǎng)基：葡萄糖0.5%，木聚糖1.0%，（NH4）2SO40.2%，MgSO40.05%，KH2PO40.1%，瓊脂粉2.0%。發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米芯4%，麩皮2%，（NH4）2SO40.5%，KH2PO40.3%，MgSO40.1%，聚乙二醇2000 0.05%，微量元素0.1%。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1200型紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；HY-211C恒溫振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；TDM低速離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；FE20pH計(jì)：上海梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SHA-C恒溫振蕩器：常州國(guó)華電氣有限公司；LGJ-10D多岐管冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；50L全自動(dòng)發(fā)酵罐：上海國(guó)強(qiáng)生化裝備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 搭載材料準(zhǔn)備[9]

根據(jù)“神舟九號(hào)”飛船的搭載條件和技術(shù)要求，按以下兩種方式搭載，孢子懸液組TG-Y黑曲霉菌株以斜面培養(yǎng)基（PDA）培養(yǎng)72 h，用無(wú)菌水清洗過(guò)濾，離心洗滌后制成1×1010CFU/mL孢子懸液（SP1），搭載。對(duì)照組（CK）為上述孢子懸液，不搭載。孢子粉組（SP2）TG-Y黑曲霉菌株以斜面培養(yǎng)基（PDA）培養(yǎng)72 h，用無(wú)菌水清洗過(guò)濾，離心洗滌后，以滅菌后20%脫脂牛奶制備懸液，凍干，搭載。對(duì)照組（CK）為上述凍干粉，不搭載。

1.3.2 搭載過(guò)程

搭載實(shí)驗(yàn)菌株的神州九號(hào)宇宙飛船于2012年6月16日在酒泉衛(wèi)星發(fā)射場(chǎng)，通過(guò)長(zhǎng)征二號(hào)F遙九火箭發(fā)射升空，2012年6月29日，神舟九號(hào)飛船返回艙成功降落在位于內(nèi)蒙古中部的主著陸場(chǎng)預(yù)定區(qū)域，2012年7月5日，樣品送回河南天冠企業(yè)集團(tuán)。

1.3.3 誘變菌株培養(yǎng)

“神舟九號(hào)”飛船搭載菌種返回后，將各搭載組的試管中孢子用無(wú)菌生理鹽水洗出，離心洗滌3次，將所得孢子進(jìn)行適當(dāng)稀釋后涂布于PDA培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng)36～48 h，觀察生長(zhǎng)菌落的形態(tài)狀況，并計(jì)算未搭載菌株與搭載菌株的存活率和形態(tài)突變率，存活率和形態(tài)突變率計(jì)算公式如下：

1.3.4 高產(chǎn)突變株篩選

采用透明圈法[10]初篩，初步淘汰低產(chǎn)酶菌株，并在PDA培養(yǎng)基上將初步篩選出的高產(chǎn)空間誘變株進(jìn)行4、5代傳代培養(yǎng)。將初步篩選出的菌株轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基，培養(yǎng)96 h后，制成2×107CFU/mL孢子懸液，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩，測(cè)定酶活力。搖瓶實(shí)驗(yàn)將孢子懸液以10%接種量接種于50 mL/250 mL三角瓶中，30 ℃、210 r/min條件下培養(yǎng)96 h，測(cè)定木聚糖酶活力。

1.3.5 酶活力測(cè)定

參照楊付偉等[11-12]木聚糖酶活力測(cè)定方法，略有改動(dòng)。

1.3.6 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

在PDA培養(yǎng)基上將復(fù)篩所得到的產(chǎn)酶突變株每半月進(jìn)行1次的傳代培養(yǎng)，連續(xù)傳代7～8代，并搖瓶發(fā)酵測(cè)定酶活力。

1.3.7 放大實(shí)驗(yàn)

通過(guò)50 L全自動(dòng)發(fā)酵罐進(jìn)行產(chǎn)酶放大實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 空間誘變對(duì)黑曲霉形態(tài)的影響

黑曲霉經(jīng)空間搭載后，形態(tài)及存活率均發(fā)生了一定的變化，結(jié)果見表1。

表1 搭載后黑曲霉菌株存活率及形態(tài)突變率Table 1 Survival rate and morphology mutation ratio of Aspergillus niger loaded in spacecraft

由表1可知，與未搭載對(duì)照菌株的白色、由同心環(huán)向邊緣呈輻射狀的外觀比較，經(jīng)搭載處理的菌株形態(tài)表現(xiàn)為四類：（1）菌落大，邊緣不整齊，孢子量大。（2）菌落極小，邊緣整齊，孢子淺灰色，孢子量少。（3）菌落清晰，邊緣整齊，孢子豐富，松散，黑色。（4）菌落淺褐色，邊緣不整齊，孢子極少。SP1組形態(tài)突變率達(dá)到14.6%；SP2組形態(tài)突變率為5.4%，存活率達(dá)75.80%，這與凍干孢子處于休眠狀態(tài)在空間環(huán)境下不易發(fā)生變異有關(guān)。

2.2 空間誘變后產(chǎn)酶黑曲霉菌株的篩選

2.2.1 菌株篩選

利用產(chǎn)酶菌株能在含有低聚木糖的平板上形成透明圈，且透明圈/菌落直徑比值大小大致反映菌株產(chǎn)酶能力的高低，采用木聚糖瓊脂培養(yǎng)基平板從分離得到的1 500株產(chǎn)酶菌種初篩到10株分解木聚糖菌株，從SP1組篩選到4株，SP2組篩選到6株。

對(duì)初篩到的編號(hào)為SP1-057、SP1-191、SP1-268、SP1-523、SP2-145、SP2-336、SP2-582、SP2-651、SP1-752、SP2-801 菌株進(jìn)行復(fù)篩，連續(xù)進(jìn)行3批次搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 10菌株3批次發(fā)酵結(jié)果Fig.1 Fermentation results of 10 strains in shake flasks for 3 batches

依據(jù)圖1 發(fā)酵結(jié)果選擇產(chǎn)酶活力較高且3批次酶活力變化波動(dòng)不大的SP1-523、SP2-145、SP2-582、SP1-752、SP2-801這5株菌進(jìn)行多點(diǎn)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步確定優(yōu)良菌株。

2.2.2 多點(diǎn)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3批次，每批次取樣時(shí)間點(diǎn)為48h、72 h、84 h、96 h各測(cè)定一次酶活力，結(jié)果如表2所示。

表2 5種菌株發(fā)酵結(jié)果Table 2 Fermentation results of 5 strains at different time

由表2可知，SP1-523、SP2-801菌株發(fā)酵過(guò)程酶活力增加平穩(wěn)，單位時(shí)間內(nèi)酶活力增加幅度較大，兩者均有明顯的發(fā)酵優(yōu)勢(shì)，對(duì)兩者進(jìn)行多次傳代培養(yǎng)驗(yàn)證其遺傳穩(wěn)定性。

2.2.3 遺傳穩(wěn)定性

生產(chǎn)菌株往往存在隨著傳代次數(shù)的增加，菌株發(fā)生退化，導(dǎo)致其發(fā)酵能力降低，對(duì)于誘變菌株更易出現(xiàn)回復(fù)突變使其誘變性狀發(fā)生改變，因此對(duì)復(fù)篩到的SP1-523、SP2-801菌株進(jìn)行7次傳代培養(yǎng)，考察其遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果如表3所示。

表3 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of hereditary stability

由表3 可知，SP1-523、SP2-801菌株經(jīng)多次傳代后，發(fā)酵性能穩(wěn)定，酶活力維持在（2 000±50）IU/mL，可見經(jīng)空間誘變篩選到的SP1-523、SP2-801菌株，酶活力提高20%，且具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

2.2.4 放大實(shí)驗(yàn)

對(duì)SP1-523、SP2-801菌株進(jìn)行50 L罐放大實(shí)驗(yàn)，各自進(jìn)行五批次發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵周期120 h，酶活力結(jié)果如表4所示。

表4 菌株五批次發(fā)酵放大實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of strains scale-up experiment for 5 batches

由表4可知，經(jīng)五批次發(fā)酵放大實(shí)驗(yàn)，SP1-523、SP2-801兩菌株，發(fā)酵周期120 h，酶活力均達(dá)（2 500±50）IU/mL，與對(duì)照比酶活力提高達(dá)25%左右，可見兩菌株發(fā)酵性能穩(wěn)定，具有高酶活力特性，可用于生產(chǎn)中進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié)論

隨著我國(guó)航天工業(yè)的飛速發(fā)展，利用太空誘變獲得具有優(yōu)良性狀的微生物菌株亦成為微生物誘變育種主要手段之一[13-16]，實(shí)驗(yàn)中經(jīng)空間誘變后的黑曲霉菌株其形態(tài)和產(chǎn)酶能力均發(fā)生了不同程度的變化，通過(guò)多輪初篩、復(fù)篩獲得的SP1-523、SP2-801菌株具有高產(chǎn)木聚糖酶的能力，與出發(fā)菌株比，酶活力提高20%以上，且遺傳性能穩(wěn)定，易于培養(yǎng)，經(jīng)50 L罐放大實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)酵水平可提高25%，具備作為工業(yè)微生物的條件，可作為規(guī)模化生產(chǎn)木聚糖酶的生產(chǎn)菌株使用，經(jīng)60 m3發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)，酶活力水平提高達(dá)30%；該菌株應(yīng)用于生產(chǎn)后，在不增加投資成本的情況下可大幅降低單位酶生產(chǎn)成本達(dá)25%，從而降低纖維乙醇生產(chǎn)中酶的應(yīng)用成本，在推動(dòng)纖維乙醇產(chǎn)業(yè)化的同時(shí)，相關(guān)酶制劑產(chǎn)品亦可應(yīng)用于食品、飼料、飲料、造紙等多個(gè)領(lǐng)域，目前正通過(guò)基因工程技術(shù)手段對(duì)SP1-523、SP2-801菌株DNA序列多態(tài)性等進(jìn)行研究。

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