米曲霉種曲制備工藝優化研究

趙中開，林 艷，楊建剛*，馬瑩瑩，林 秋，吳赫川

（四川理工學院 生工學院，四川 自貢 643000）

米曲霉（Aspergillus oryzae）是美國食品藥品監督管理局公布的40多種安全微生物菌種之一[1]，是食品釀造中的常用菌株，它不僅產酶種類多[2-3]，而且酶活力高，廣泛分布于各種酒曲中，是釀酒工業中的重要微生物。毛青鐘等[4]利用米曲霉制黃酒麥曲，所得曲的糖化力、液化力都得到很大的提高，此外，清酒曲是以大米為原料，以米曲霉為菌種，采用純種培養的方法制成的酒曲。種曲即為酒曲制作時的種子[5]，是高度富含制曲微生物孢子的生物制品，其在純種制曲領域占據著至關重要的地位[6-7]。目前，國外的種曲研究比較深入，生產應用也比較普及，而我國這方面的研究與生產相對落后，有待進一步加強[8]。

目前，我國已有關于米曲霉種曲的論文報道[9-10]，但是有關釀酒用米曲霉種曲的研究所見不多。該試驗在前人所做研究的基礎上，以秈米為制曲原料，以種曲孢子數為優化指標[11]，采用均勻試驗設計方法進行試驗方案設計[12]，對米曲霉種曲的制備工藝進行優化，以期為制備優良的米曲霉酒曲提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米曲霉（Aspergillus oryzae）A52820121203：釀造酒實驗室保藏。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，水1 000 mL，pH自然。

秈米：市售；釀造水，符合GB 5749—2006《生活飲用水衛生標準》。

葡萄糖（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；乙醇體積分數95%：成都市新都區木蘭鎮工業開發區；木灰：市售；無菌水：釀酒實驗室制備。

1.2 儀器與設備

LHP-250恒溫培養箱：常州普天儀器制造有限公司；BH200生物顯微鏡：寧波舜字儀器有限公司；SYQ-DSX-280B高溫蒸汽滅菌鍋：申安醫療器誡廠；6102電子天平：杭州友恒稱重有限公司；BCD-256L電冰箱：青島樂家電器有限公司；WJ-JZX無菌接種箱：濟南杰康濟南凈化設備廠；血球計數板：玉環縣求精醫用儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 種曲制作工藝流程

1.3.2 工藝操作說明

洗米：除去附在碎米表面的雜質，如糠、塵土及夾雜物等。

浸米：由于秈米的吸水性較差，故需浸泡較長時間，在20 ℃的條件下，需浸泡12 h以上。當米粒從外觀上看透明感消失，變成純白色，用手碾米粒能將米粒碾碎時，即可將秈米撈出，瀝水0.5 h后，分裝蒸米。

蒸米：用高壓蒸汽滅菌鍋蒸米，條件為110 ℃、45 min。使蒸出的秈米熟而不爛，內無白心生米。

接種：以無菌操作的方式按照相應的接種量接入米曲霉孢子粉。

添加木灰：以無菌操作的方式按照相應的木灰添加量加入木灰，拌勻。木灰是米曲霉種曲制備過程中非常關鍵的一種添加物，其主要作用體現在兩個方面，一是為米曲霉的生長提供必要的礦物質元素，促進米曲霉產生孢子；二是使培養基更加的松散，為培養基內部通氣和散熱創造條件。

扣瓶：米曲霉是一種好氧性微生物[13]，其菌絲在生長時會相互纏繞，造成米粒結塊，導致曲料內部缺氧，因此應及時扣瓶，將結塊的米粒打散。本試驗的扣瓶頻率為每12 h一次。

種曲培養：接種后第1天為米曲霉孢子的萌發階段，溫度為31 ℃，從第2天起根據不同試驗要求設定培養溫度（14～46 ℃）。根據不同試驗設定培養時間為1～10 d，培養結束時一般肉眼可觀察到大量綠色米曲霉分生孢子的生成。

1.3.3 孢子數測定

樣品稀釋：精確稱取種曲1.00 g，倒入盛有玻璃珠的250 mL錐形瓶內，加體積分數95%酒精5 mL，加無菌水20 mL，加稀硫酸10 mL，充分振搖，使分生孢子分散，然后用多層紗布過濾、沖洗，使濾渣不含孢子，稀釋至500 mL。

制片：用膠頭滴管取稀釋液l滴，滴于血球計數板的計算格上，然后將蓋玻片輕輕由一邊向另一邊壓下，使蓋片與計數板完全密合，計數區內無氣泡，用濾紙吸干多余的溢出孢子液，靜置數分鐘，待孢子沉降。

觀察計數：采用血球計數板計數，用低倍鏡頭或高倍鏡頭觀察。孢子常位于大格的雙線上，應全部取二邊計數，舍棄另二邊，以免重復計數。本試驗采用的是25×16型的計數板，需要數左上、左下、右上、右下和中間共計5個大格的孢子數，每個樣品重復觀察兩次，其平均值即為該樣品種曲的孢子數，孢子數計算公式如下。

式中：N表示80個小格內的孢子總數，個；n表示稀釋倍數。

1.3.4 單因素試驗

接種量對種曲孢子數的影響：在250 mL三角瓶中分別裝入30 g已浸泡并瀝干水的大米，經高壓滅菌鍋滅菌后，分別按接種量0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%接入米曲霉孢子粉，再分別添加1%的木灰，拌勻后31 ℃培養1 d，30 ℃培養4 d，前兩天每隔12 h扣瓶一次，培養結束后計種曲孢子數。

木灰添加量對種曲孢子數的影響：在250 mL三角瓶中分別裝入30 g已浸泡并瀝干水的大米，經高壓滅菌鍋滅菌后，分別按上述所確定的最佳接種量接入米曲霉孢子粉，再分別添加0、1%、2%、3%、4%的木灰，拌勻后按上述條件培養，培養結束后計種曲孢子數。

溫度對種曲孢子數的影響：在250 mL三角瓶中分別裝入30 g已浸泡并瀝干水的大米，經高壓滅菌鍋滅菌后，分別按上述所確定的最佳接種量接入米曲霉孢子粉，最佳的木灰添加量加入木灰，拌勻后31 ℃培養1 d，而后分別在14 ℃、22 ℃、30 ℃、38 ℃、46 ℃培養4 d，前兩天每隔12 h扣瓶一次，培養結束后計種曲孢子數。

時間對種曲孢子數的影響：在250 mL三角瓶中分別裝入30 g已浸泡并瀝干水的大米，經高壓滅菌鍋滅菌后，分別按上述所確定的最佳接種量接入米曲霉孢子粉，以最佳的木灰添加量加入木灰，拌勻后31 ℃培養1 d，而后分別在上述所確定的最佳溫度下培養，包括種子萌發培養時間（1 d）分別培養3 d、5 d、7 d、9 d、11 d，前兩天每隔12 h扣瓶一次，培養結束后計種曲孢子數。

1.3.5 均勻試驗設計方案

在單因素試驗的基礎上，以接種量、木灰添加量、培養時間和溫度為優化種曲孢子數的4個因素，確定各因素與水平，具體的因素水平見表1。

其中，對溫度取4個水平，其余3個因素均取6個水平，具體的因素水平見表1。

表1 孢子數優化均勻試驗因素水平Table1 Factors and levels of the uniform experiment for spore number optimization

2 結果與分析

2.1 單因素試驗優化米曲霉培養條件

2.1.1 接種量對種曲孢子數的影響

不同接種量下培養結束后種曲孢子數結果見圖1。由圖1可知，接種量小時，接入的生物量不足，培養基的營養過剩，種曲的孢子數也少，隨著接種量增加種曲孢子數量也在增多，當接種量增加至0.10%時，種曲孢子數最多，故選擇接種量為0.10%。

圖1 接種量對種曲孢子數的影響Fig.1 Effect of inoculum on spore number of seed koji

2.1.2 木灰添加量對種曲孢子數的影響

圖2 木灰添加量對種曲孢子數的影響Fig.2 Effect of wood ash addition on spore number of seed koji

不同木灰添加量下培養結束后種曲中孢子數測定結果見圖2。木灰的添加量過多過少都會影響種曲孢子的數量，一定量的木灰不僅可以為米曲霉的生長提供必要的礦物質元素，促進米曲霉產生孢子，還可以使培養基更加松散，為培養基內部通氣和散熱創造條件，由圖2可以看出，種曲孢子數隨木灰添加量先增加后減少，當木灰添加量為1%時，種曲孢子數最多，故選擇木灰添加量為1%。

2.1.3 溫度對種曲孢子數的影響

不同培養溫度下培養結束后種曲中孢子數測定結果見圖3。由圖3可知，微生物的活動受溫度影響極其明顯，微生物的生長均有其特定的最佳溫度范圍，溫度過低過高都影響其體內的生理生化反應，如酶活性，從而影響其生長代謝。米曲霉的最適生長溫度30～35 ℃，＜25 ℃生長緩慢，＞40 ℃生長困難。培養溫度過低或過高，均無法產孢子，在培養溫度30 ℃時種曲孢子數最多，故選擇培養溫度為30 ℃。

圖3 培養溫度對種曲孢子數的影響Fig.3 Effect of culture temperature on spore number of seed koji

2.1.4 培養時間對種曲孢子數的影響

圖4 培養時間對種曲孢子數的影響Fig.4 Effect of culture time on spore number of seed koji

不同培養時間下培養結束后種曲中孢子數測定結果見圖4。由圖4可知，培養時間過短，菌絲處于營養生長階段，產孢子不足，隨著培養時間的增加，米曲霉生長進入繁殖階段，大量分生孢子形成，種曲孢子數增多，在第7天達到最高值，而后隨時間延長，易產生大量的休眠孢子，也有一部分孢子二次萌發，種曲孢子數趨于穩定。故選擇培養時間為7 d。

2.2 均勻試驗優化米曲霉種曲培養條件

由于本試驗中包含3個6水平因素和1個4水平因素，故需采用混合水平均勻設計表來安排試驗。根據本試驗的實際情況，盡量減少試驗誤差，選用均勻試驗表U12（12×62×4）來安排試驗。由于該表的第1列有12個水平，所以還需采用擬水平法將該列相鄰的2個水平合并為因素水平表中的1個水平，試驗方案詳見表2，模型回歸統計與方差分析見表3～表5。

由表2可以看出，各因素的相關組合下米曲霉種曲的產孢子數的變化。當培養時間為8 d，接種量為0.10%，木灰添加量為1.8%，培養溫度30 ℃時，種曲產孢子數最多，為5.9×108個/g。

應用SPSS軟件中的線性回歸分析程序對試驗數據進行處理[14-15]，得到統計結果見表3～表5。

表2 均勻試驗設計方案及結果Table 2 Designation and results of uniform experiment

表3 模型回歸統計Table 3 Model regression statistics

表4 回歸方程的方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

表5 回歸系數方差分析Table 5 Variance analysis of regression coefficient

由表3可知，該模型的R2=0.952，說明該回歸方程擬合較好。由表4可知，P=0.001（＜0.05），說明回歸方程模型是極顯著的。由表5可知，回歸方程Y=7.996-0.482X2-0.083X12-0.004X42+0.509X1X3-0.048X3X4，根據R2=0.952和表4中方差分析可以判斷回歸方程非常顯著（P＜0.01）；再根據t檢驗結果，所有的偏回歸系數也都顯著（P＜0.05）。所以，建立的回歸方程有意義。

由表5可知，各因素對種曲孢子數影響的主次順序為：X1X3＞X12＞X3X4＞X2＞X42。

利用Excel的規劃求解功能對回歸方程進行求解，得到的極值點為：X1=6.43，X2=0.1，X3=2.1，X4=25，按實際操作即培養時間6.4 d，接種量0.1%，木灰添加量2.1%，培養溫度25 ℃。將此最佳培養條件代入回歸方程，得到最佳培養條件下的預期孢子數為6.37×108個/g。在最佳條件下對預測值進行驗證，最后得到的孢子數真實值為6.33×108個/g，與預測值接近。

3 結論

試驗以秈米為原料，應用均勻試驗設計方法對米曲霉種曲的制備工藝進行了研究。經均勻試驗優化后，確定按實際操作的最佳培養條件為：培養時間6.4 d，接種量0.1%，木灰添加量2.1%，培養溫度25 ℃。在此條件下制備的種曲的孢子數為6.33×108個/g，與預測值很接近，說明回歸模型較為可靠。通過本試驗種曲制備的優化，在釀造生產中可直接減少種曲用量，有利于經濟效益的提高。

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