功能性紅曲中三類主要聚酮類化合物合成途徑相關基因研究進展

陳 泉，吳遠征，趙曉燕，趙吉興，李 耀，李紀順*

（1.山東省科學院中日友好生物技術研究中心，山東省應用微生物重點實驗室，山東 濟南 250014；2.山東中惠食品有限公司，山東 惠民 251706）

紅曲又稱月曲、神曲、紅曲米，是以紅曲霉為主發酵生產的一種獨特的米曲，在我國已有1 000多年的歷史，中國古代諸多書籍中都記載了紅曲具有著色、防腐、保健、醫藥等作用。近年來，隨著人們對紅曲藥用、生理價值的深入研究，人們已經開發出對高血壓、高血脂等具有顯著療效的功能性紅曲產品。

功能性紅曲是指以大米等為原料，利用純培養的紅曲霉發酵生成的含發酵自然產生的洛伐他汀等生物活性物質的紅曲。功能性紅曲中發揮降血壓、降血脂等作用的主要是紅曲霉在發酵過程中產生的一些次級代謝產物，而在這些次級代謝產物中，影響功能性紅曲品質的是三類主要的聚酮類化合物：洛伐他汀、桔霉素和紅曲色素。洛伐他汀是紅曲中主要的降脂因子，輕工行業標準QB/T 2847—2007《功能性紅曲米（粉）》把洛伐他汀作為功能紅曲的特征性功能成分，要求洛伐他汀的含量必須＞0.4%[1]。目前，功能性紅曲產品的價格高昂并以洛伐他汀的含量高低而定。國家標準GB/T 5009.222—2008《紅曲類產品中桔青霉素的測定》規定了紅曲產品中桔霉素的測定方法，本標準對液態樣品中桔霉素的含量的定量限為50 μg/L，固態樣品為l mg/kg[2]，輕工行業標準QB/T 2847—2007規定功能性紅曲米（粉）中的桔霉素含量（以絕干計）≤50 μg/kg[1]。

為了提高功能性紅曲的品質，研究人員圍繞這三類聚酮類化合物在誘變育種、原生質體融合育種以及發酵工藝優化等方面進行了大量深入細致的研究工作[3-5]。而隨著基因工程技術的發展，研究人員逐漸將重點放在對這三類化合物合成途徑相關基因的研究上，這樣有利于深入理解它們各自的合成途徑，為從根本上提高功能性紅曲產品的品質提供理論依據和技術支持。本文對目前報道的洛伐他汀、桔霉素和紅曲色素合成途徑中相關基因的研究進展進行了概述，有利于促進基因工程技術在功能性紅曲產品的研究和生產中發揮更加重要的作用。

2 三種聚酮類化合物研究

2.1 洛伐他汀

對于洛伐他汀生物合成途徑及相關酶和基因的最初認識主要源于對土曲霉的研究[6]。研究發現，參與土曲霉洛伐他汀合成途徑的酶包括：兩個多聚乙酰合成酶洛伐他汀二酮體合成酶（lovastatin diketone synthetase，LDKS）和洛伐他汀九酮體合成酶（lovastatin nonaketide synthetase，LNKS）（分別由lovB和lovF基因編碼）、轉酯酶（由lovD基因編碼）、烯酯酰還原酶（由lovC基因編碼）和P450單加氧酶（由lovA基因編碼）[7-9]。其具體合成途徑如圖1所示。LNKS和LDKS均含有酮合成酶（ketosynthase，KS）、酰基轉移酶（acyltransferase，AT）、酮還原酶（ketoreductase，KR）、脫水酶（dehydratase，DH）、酰基載體蛋白（acyl carrier protein，ACP）及甲基轉移酶（methyltransferase，MeT）功能域，并分別參與合成洛伐他汀九酮主體和二酮側鏈，再由lovD編碼的轉酯酶將二者連接起來合成洛伐他汀[10]。

圖1 洛伐他汀的生物合成途徑[6]Fig.1 Biosynthetic pathway of lovastatin

2008年，CHEN Y P等[11]利用土曲霉中lovB基因的保守序列為探針，從叢毛紅曲霉（Monacus pilosus）BCRC38072的人工染色體文庫中克隆到一段42 kbp的DNA序列（GenBank No.DQ176595）。經序列分析發現，該片段為一個包含與土曲霉洛伐他汀合成基因高度同源的基因片段mokA-mokI的洛伐他汀合成基因簇（表1）。經氨基酸序列分析證實，mokA和mokB都含有同土曲霉中多聚乙酰合成酶結構相近的KS、AT、DH、MeT、KR功能域。另外，CHEN Y P等[11]還利用基因打靶載體敲除了叢毛紅曲霉BCRC38072中的mokA基因，mokA基因缺失菌株經發酵后檢測發現其不再有合成洛伐他汀的能力，這進一步證實了mokA在參與洛伐他汀合成中的作用。隨后，SAKAI K等[12]在敲除了叢毛紅曲霉中的mokB基因后發現，在該叢毛紅曲霉的發酵產物中雖然檢測不到洛伐他汀，但是卻有洛伐他汀的前體物莫納可林的存在。這說明mokB是參與洛伐他汀二酮側鏈的合成，印證了之前CHEN Y P等[11]的氨基酸序列分析結果。

表1 紅曲霉洛伐他汀生物合成基因簇分析[6]Table 1 Gene cluster of lovastatin biosynthetic in Monascus

為了進一步證實上述分析結果，2009年，CHEN Y P等[13]又利用叢毛紅曲霉內源的3-磷酸甘油醛脫氫酶啟動子的mokH超表達載體轉化叢毛紅曲霉BCRC38072，篩選得到3個mokH基因多拷貝菌株。經檢測發現，mokH基因多拷貝菌株合成洛伐他汀的能力提高了2倍左右。而且，通過PT-PCR分析發現，mokH基因多拷貝菌株中洛伐他汀合成相關基因的表達均早于出發菌株，證實了mokH作為轉錄因子對洛伐他汀合成基因的正調控作用。此外，研究者們還發現laeA編碼的調控因子對于曲霉屬的洛伐他汀合成也具有調控作用。BOK J W等[14]研究了構巢曲霉（Aspergillus nidulans）的laeA基因對在其異源表達的洛伐他汀合成基因的調控作用。研究發現，敲除laeA基因的菌株，lovC和lovE表達量明顯降低，莫納可林的產量也隨之下降；而過量表達laeA基因的菌株lovC和lovE表達量顯著提高，莫納可林的產量提高了4倍。最后，在土曲霉中過量表達了來源于構巢曲霉的laeA基因，發現洛伐他汀的產量提高了4～7倍。紅曲霉中也存在類似的調控因子MplaeA。ZHANG M Y等[15]研究了紅曲霉中MplaeA的兩種mRNA（d-MplaeA和l-MplaeA）的選擇性拼接方式，發現MplaeA對紅曲霉洛伐他汀的合成能力具有明顯的調控作用。

2.2 桔霉素

1999年，HAJJAJ H等[16]利用13C標記乙酸的方式證實，桔霉素的合成起始于多聚乙酰的合成，其具體合成途徑如圖2所示。對桔霉素合成相關基因的研究最早開始于2005年，SHIMIZU T等[17]利用簡并引物從紫色紅曲霉（M.purpureus）中克隆得到了全長為7 838 bp的一段DNA片段，該片段編碼包含KS、AT、ACP和一個甲基轉移酶在內的由2 593個氨基酸組成的蛋白功能域，該片段后來被命名為pksCT（GenBank No.AB167465）。隨后，研究人員敲除了紫色紅曲霉中的這段pksCT基因編碼的KS功能域或ACP功能域，結果發現敲除后菌株不再產生桔霉素，而且其色素產量也未受到影響。這說明pksCT基因指導紫色紅曲霉中桔霉素前體多聚乙酰的合成。

圖2 桔霉素生物合成途徑Fig.2 Biosynthetic pathway of citrinin

2007年，SHIMIZU T等[18]又克隆出了一段長為21 kbp的包括pksCT及其側翼的序列，并研究發現由ctnA編碼的一段576個氨基酸組成的蛋白序列控制pksCT和orf5的轉錄，是桔霉素合成的主要轉錄激活因子。2008年，SAKAI K等[19]構建了桔霉素合成的異源表達系統，將桔霉素合成基因簇轉入米曲霉（Aspergillus oryzae）中，獲得可以穩定產生桔霉素的菌株。為了降低紅曲霉中桔霉素的含量，研究者利用基因工程技術敲除桔霉素合成的相關基因，并取得了不錯的效果。FU G[20]等利用潮霉素選擇性標記置換橙色紅曲霉Li AS3.4384中的pksCT序列，使桔霉素的含量降低了98%；JIA X Q等[21]同樣敲除了紫色紅曲霉SM001中的pksCT基因，獲得了一株不產桔霉素的工程菌；LI Y P等[22]敲除了橙色紅曲霉Li AS3.4384中的ctnB基因，該基因位于pksCT和ctnA基因之間，編碼的是一個氧化還原酶。得到的ctnB基因缺陷型菌株基本檢測不到桔霉素的產生；周禮紅[23]通過GenBank公布的紫色紅曲霉桔霉素聚酮體編碼序列設計引物擴增得到紅色紅曲霉CICC5006的桔霉素合成酶相關基因序列，構建了pBpksCTIHygro載體以及通過其中的酮酯酰合成酶的N 端序列構建的pBpksCW2Hygro分別破壞pksCT基因，均實現了桔霉素合成的阻斷；徐民俊[24]利用ctnR的無效等位基因片段置換紫色紅曲霉中的ctnR轉錄激活因子，在不引入外源抗性基因的情況下使紫色紅曲霉產生的桔霉素含量減少近50%。

2.3 紅曲色素

紅曲色素廣泛應用于腌制品和肉制品的著色防腐，具有保健功效和藥用價值，在世界各地都有巨大的市場，在東南亞國家的應用尤為廣泛[25-27]。目前已知的紅曲色素主要有10種，包括6種醇溶性色素和4種水溶性色素，在顏色上主要有紅色、黃色和橙色3種。紅曲色素的合成過程與洛伐他汀和桔霉素的合成過程類似，以紅斑紅曲素為例展示的紅曲色素的合成過程見圖3[28]。首先由1 mol丁烯酰輔酶A（coenzyme A，CoA）和4 mol丙二酰CoA在聚酮合酶的作用下生成六聚酮化合物，隨后由脂肪酸生物合成途徑產生的己酸與六酮聚酮化合物經醛醇縮合。最后，經脫水反應生成紅曲玉紅素。對紅曲色素合成過程相關基因的研究起步較晚，在這方面的研究也一直處于有爭議的階段。

圖3 紅曲色素(以紅斑紅曲素為例)生物合成途徑Fig.3 Biosynthetic pathway of Monascus pigment (rubropunctatin as a case)

直至2013年，BALAKRISHNAN B等[28]分析利用三螺旋DNA（T-DNA）隨機突變紫色紅曲霉得到的白化突變株W13后發現，該菌株內的一個編碼聚酮合酶的基因MpPKS5以及與之相鄰的一個轉錄調節基因mppR1的表達水平明顯下調。隨后，又針對性地表達失活MpPKS5后也得到了不產紅曲色素的菌株。因此，認為MpPKS5和mppR1都是紅曲色素合成基因簇中的一員。然后，通過與GenBank公布的叢毛紅曲霉（因為紫色紅曲霉目前沒有較完整的基因組序列信息）的基因序列進行比對和分析，結果見圖4。由圖4可知，基因簇應該為叢毛紅曲霉的紅曲色素合成基因簇。該基因簇包含：聚肽合酶、脂肪素合酶、轉錄激活因子、酰基轉移酶、氧化還原酶、羥基化酶等不同功能的酶。隨后，XIE N等[29]利用單側寡聚核苷酸嵌套-PCR（SON-PCR）從紅色紅曲霉中克隆到一段56 000 bp的紅曲色素合成酶基因簇，該基因簇包含有聚酮酶基因、脂肪酸合酶基因、酯酶基因、脫水酶基因、轉運蛋白基因和一個調節基因pigR。將pigR基因敲除后發現紅曲霉不再具有合成紅曲色素的能力。而LIU Q等[30]在敲除紅色紅曲霉（M.ruber）中的一個編碼黃曲霉毒素醛還原酶的MpigE基因之后，獲得的缺陷株只能產生黃色色素和極少量的紅色色素，而出發菌株卻能夠產生紅色、黃色和橙色三種顏色的色素。將MpigE基因在上述缺陷菌株中回補表達后，紅曲霉又恢復了合成紅色和橙色色素的能力。這表明MpigE基因可能參與各種色素組分之間的轉化。發現在過量表達MpigE基因后，紅曲霉產生的桔霉素產量大幅降低。

圖4 紅曲霉紅曲色素生物合成相關基因簇Fig.4 Monascus pigment biosynthetic related gene cluster in Monascus

3 前景與展望

洛伐他汀、桔霉素和紅曲色素是影響功能性紅曲產品品質的重要因素，現階段控制它們產量的方法還多數停留在誘變育種和優化發酵策略兩種方式上。這造成研究和生產都具有一定程度的偶然性和盲目性，不利于功能性紅曲產業化的發展。文章從分子生物學角度對目前報道的洛伐他汀、桔霉素和紅曲色素的合成過程及合成途徑相關基因的研究進展進行綜述，有利于更加深入的了解其合成過程，以期通過有效的手段大幅度提高功能性紅曲產品的產量和品質，將會成為未來的發展重點和熱點。然而，相對于大部分工業化菌株來說，對紅曲霉菌株基因功能方面的研究還處于初期階段，相信隨著科學的發展和技術的進步，對于紅曲霉基因功能的研究將更加深入和透徹，基因工程技術和代謝工程技術也會在紅曲霉產品的生產應用中發揮越來越多的作用。

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