浙江臺(tái)州地區(qū)老年2型糖尿病患者TNF-α基因多態(tài)性檢測(cè)與分析

饒高峰 沈屹 吳金友 陳恩富 曾愛(ài)平

浙江臺(tái)州地區(qū)老年2型糖尿病患者TNF-α基因多態(tài)性檢測(cè)與分析

饒高峰 沈屹 吳金友 陳恩富 曾愛(ài)平

目的 研究TNF-α基因多態(tài)性在浙江臺(tái)州地區(qū)2型糖尿病患者中的分布與相關(guān)性。方法利用DNA測(cè)序法對(duì)100例老年2型糖尿病患者（觀察組）及50例健康體檢者（對(duì)照組）的TNF-α基因-308位點(diǎn)和-238位點(diǎn)進(jìn)行基因檢測(cè)與分析。結(jié)果觀察組FPG、TNF-α、TG、TC、胰島素抵抗指數(shù)（IRI）分別為（10．68±2．75）mmol/L、（2．01±0．25）ug/L、（2．43±1．15）mmol/L、（5．49±1．63）mmol/L及4．65±0．97，均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05），HDL為（1．23±0．28）mmol/L，低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。而B(niǎo)MI、LDL[（25．34±2．41）kg/m2、（3．26±1．3）mmol/L]與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。TNF-α基因-308位點(diǎn)在觀察組和對(duì)照組GA+AA基因頻率分別為31%和10%，A等位基因頻率分別為16%和5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。而-238位點(diǎn)未見(jiàn)突變，兩組間比較無(wú)明顯差異。結(jié)論TNF-α基因G-308A單核苷酸多態(tài)性與2型糖尿病存在相關(guān)性。

老年人2型糖尿病 腫瘤壞死因子 單核苷酸多態(tài)性

糖尿病是嚴(yán)重影響人類(lèi)健康的疾病之一。研究表明2型糖尿病是一種免疫性疾病，是細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，炎癥在其發(fā)病機(jī)制中起媒介作用。近年來(lái)對(duì)腫瘤壞死因子α（TNF-α）的研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α基因多態(tài)性與糖尿病的發(fā)生有關(guān)[1-2]，但其與老年糖尿病患者的發(fā)病是否相關(guān)，目前尚不清楚。TNF-α基因存在多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，基因多態(tài)性影響TNF-α基因產(chǎn)物的表達(dá)，進(jìn)而可能影響老年人對(duì)于糖尿病的易感性及患病的嚴(yán)重程度。近來(lái)TNF-α基因啟動(dòng)區(qū)第308位（-308）和Y盒第238位（-238）的單核苷酸多態(tài)性（SNP）成為研究熱點(diǎn)[3]。本研究分析2型糖尿病患者及健康體檢者的TNF-α基因-308位點(diǎn)（-308）和-238位點(diǎn)（-238）進(jìn)行基因多態(tài)性，探討TNF-α基因-308及-238的SNP位點(diǎn)與老年2型糖尿病發(fā)病的相關(guān)性。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選擇2011-06—2013-06我院內(nèi)分泌科住院及門(mén)診老年2型糖尿病患者100例（觀察組），其中男55例，女45例，年齡60～85（68.51±4.63）歲；診斷符合1997年ADA老年糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有患者均為初診，未經(jīng)任何降糖藥物等治療，無(wú)嚴(yán)重心、肝、腎疾病、糖尿病慢性并發(fā)癥及其它內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病。選擇同期健康體檢者50例作為對(duì)照組，其中男28例，女22例，年齡60～82（66.71±5.32）歲。所有研究對(duì)象均為浙江臺(tái)州地區(qū)人群，且無(wú)血緣關(guān)系。兩組性別、年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 代謝指標(biāo)檢測(cè) 受試者空腹8～10h后抽取肘靜脈血2ml，采用EDTA抗凝，置于-20℃冰箱中備抽取DNA和檢測(cè)TNF-α的基因；非抗凝血5ml凝固后離心分離血清。直接送檢FPG、TG、TC、HDL-C、LDL-C、空腹血漿胰島素等指標(biāo)。采用Beckman全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)上述指標(biāo)。采用放射免疫檢測(cè)兩組TNF-α和空腹血漿胰島素水平。胰島素抵抗指數(shù)（IRI）計(jì)算采用公式：IRI=空腹血糖×空腹血漿胰島素/22.5。

1.2.2 基因型檢測(cè) （1）樣本基因組DNA提取：取EDTA抗凝血2ml，用飽和氯化鈉法提取。PCR擴(kuò)增目的片斷：引物序列（寶生物工程公司合成）為上游：5′-CCCCTCCCAGTTCTAGTTCTATC-3′，下游：5′-GAATCATTCAACCAGCGGAAA-3′。（2）PCR反應(yīng)體系：20μl反應(yīng)體系中含有1×PCR緩沖液，200μmol/L dNTP，上下游引物各0.1μmol/L，基因組DNA 100ng，Taq酶2U。（3）反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；40個(gè)循環(huán)：94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸5min。（4）PCR產(chǎn)物測(cè)序：擴(kuò)增產(chǎn)物按照寶生物PCR產(chǎn)物回收試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟進(jìn)行回收純化，純化產(chǎn)物由寶生物工程公司測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 觀察組及對(duì)照組代謝指標(biāo)比較 見(jiàn)表1。

表1 觀察組及對(duì)照組代謝指標(biāo)比較

由表1可見(jiàn)，觀察組TG、TC、TNF-α、IRI均高于對(duì)照組，F(xiàn)PG顯著高于對(duì)照組，HDL-C低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。兩組BMI和LDL-C比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 患者DNA樣本PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果 見(jiàn)圖1。

由圖1可見(jiàn)，TNF-α基因-238位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果全部為野生型GG（圖1A），未見(jiàn)點(diǎn)突變。而-308位點(diǎn)有3種基因型GG、GA和AA，其中GA為雜合型。

2.3 觀察組和對(duì)照組TNF-α基因型、等位基因的分布和頻率比較 見(jiàn)表2。

表2 TNF-α基因型、等位基因的分布和頻率比較[例（%）]

由表2可見(jiàn)，觀察組GA基因型頻率為28%，AA基因型頻率為3%，A等位基因頻率為16%，因此可知觀察組GA+AA基因型頻率為31%，觀察組A等位基因頻率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，2型糖尿病是一種多基因疾病，但病因和發(fā)病機(jī)制尚無(wú)定論。探索2型糖尿病的病因及針對(duì)病因的治療預(yù)防措施是國(guó)內(nèi)外研究的重要課題。2型糖尿病是胰島素抵抗（IR）和胰島功能障礙相互作用的結(jié)果，IR不僅是2型糖尿病發(fā)生和發(fā)展的重要因素，也是引起一系列代謝異常如血脂異常的核心。TNF-α是一種具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，近年在一些動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)TNF-α可過(guò)度表達(dá)，通過(guò)抑制外周組織葡萄糖攝取、抑制胰島素受體及其底物磷酸化導(dǎo)致IR的發(fā)生[4]。IR是2型糖尿病的重要致病因素之一。鑒于TNF-α基因的生物學(xué)活性及其基因多態(tài)性特點(diǎn)，TNF-α基因可能是2型糖尿病的候選基因之一。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在臨床代謝指標(biāo)方面，觀察組TC、TG、TNF-α、IRI均高于對(duì)照組，而HDL低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。國(guó)內(nèi)外對(duì)TNF-α基因多態(tài)性與IR或其相關(guān)代謝紊亂進(jìn)行了大量研究。基因多態(tài)性影響其產(chǎn)物的表達(dá)，不同的基因型可以產(chǎn)生不同的蛋白，從而影響疾病的易感性及嚴(yán)重性。TNF-α基因存在多個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)，其一是位于基因啟動(dòng)子區(qū)第308位由A取代G，未突變時(shí)可被限制性內(nèi)切酶NcoⅠ酶切，存在GG（無(wú)突變）、GA（突變雜合子）和AA（突變純合子）3種基因型[5]。TNF-α基因多態(tài)性與2型糖尿病的關(guān)系目前國(guó)內(nèi)外研究結(jié)論不一致。Fernadez-Real等[6]報(bào)道TNF-α第308位A等位基因攜帶者胰島素敏感指數(shù)明顯下降，認(rèn)為T(mén)NF-α基因多態(tài)性與IR有一定相關(guān)性。Wilson等[7]報(bào)道，與TNF-α野生型的基因型相比，突變的基因型使Raji細(xì)胞中的TNF-α的轉(zhuǎn)錄效率增加6～7倍，而轉(zhuǎn)錄效率是TNF-α表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因素，TNF-α基因調(diào)節(jié)的變異導(dǎo)致脂肪細(xì)胞中TNF-α表達(dá)增加。Shao等[8]對(duì)440例中國(guó)香港地區(qū)的居民（其中240例2型糖尿病患者）TNF-α啟動(dòng)子-308G/A基因多態(tài)性與糖尿病的關(guān)系進(jìn)行研究后認(rèn)為，TNF-α啟動(dòng)子-308G/A基因多態(tài)性與糖尿病的發(fā)生無(wú)關(guān)。

圖1 患者DNA樣本PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果[A：-238位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果（基因型GG）；B：-308位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果（基因型GG）；C：-308位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果（基因型GA）]

本研究表明浙江臺(tái)州地區(qū)老年2型糖尿病患者GA+AA基因型頻率為31%，A等位基因頻率為16%，均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TNF-α基因-308位點(diǎn)在觀察組中變異的GA基因型頻率為28.0%，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而-238位點(diǎn)在兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。觀察組和對(duì)照組的TNF-α差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步研究可知TNF-α基因型與其存在正相關(guān)。TNF-α第308位GA變異可能通過(guò)使TNF-α水平增高而增加IR和血脂代謝異常，從而參與2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展，這種結(jié)果與Wilson等[5]的研究一致。說(shuō)明TNF-α基因-308位點(diǎn)G/A單核苷酸多態(tài)性與老年2型糖尿病的發(fā)生有相關(guān)性。不過(guò)，2型糖尿病是一個(gè)多基因遺傳的疾病，雖然TNF-α基因-308位點(diǎn)的多態(tài)性可能通過(guò)影響TNF-α表達(dá)與IR有一定的關(guān)聯(lián)，但在2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展中不一定起到?jīng)Q定性作用。

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TNF-α G308A and G238A polymorphism in patients with type 2 diabetes mellitus in Taizhou region

Objective To investigate the polymorphism of TNF-α gene in patients with type 2 diabetes mellitus(T2DM)in Taizhou region of Zhejiang province．MethodsBlood specimens were collected from 100 elderly patients with type 2 diabetes mellitus and 50 normal elderly subjects from Taizhou region of Zhejiang Province．Genomic DNA was extracted from blood samples．The primers of PCR for the SNPs of G308A and G238A were optimized and the polymorphism of amplicons was analyzed by DNA sequencing．ResultsFPG,TNF-α,TG,TC and insulin resistance index in T2DM group were 10．68±2．75mmol/L,2．01± 0．25μg/L,2．43±1．15mmol/L,5．49±1．63mmol/L and 4．65±0．97,respectively,which were all higher than those in control group (P＜0．05)．The HDL-C(1．23±0．28mmol/L)was lower than that in controls(P＜0．05),while there was no difference in BMI(25．34± 2．41kg/m2)and LDL(3．26±1．3mmol/L)between T2DM patients and controls(P＞0．05)．The frequency of GA+AA genotype in TNF-α-308 gene of T2DM group and control group was 31%and 10%，and A allele 16%and 5%,respectively(P＜0．05);while there was no difference in genotype and A allele frequency in TNF-a-238 gene between two groups．ConclusionThe 308 G-A polymorphism of TNF-α promoter gene may be associated with type 2 diabetes mellitus in elderly patients from Taizhou region of Zhejiang province．

Type 2 diabetes mellitus in elderly patients Tumor necrosis factor-α SNP

2013-09-11）

（本文編輯：楊麗）

浙江省臺(tái)州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（072KY46）

317500 溫嶺市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科（饒高峰、吳金友、陳恩富、曾愛(ài)平）；浙江省臺(tái)州醫(yī)院路橋院區(qū)內(nèi)分泌科（沈屹）