細胞內吞和自噬的新標志物VCP/p97

劉中洋，劉艷，襲榮剛，王曉波

1.沈陽軍區 藥物研究所，遼寧 大連 116015；2.解放軍第210醫院，遼寧 大連 116015

含纈酪肽蛋白（valosin-containing protein，VCP）是與多種細胞活性相關的三磷酸腺苷酶超家族（ATPases associated with various cellular activities，AAA）中的一員，是糖基磷脂酰肌醇連接的轉鐵蛋白同系物，又稱黑色素轉鐵蛋白或p97，參與核酸的重建、膜損傷、細胞周期調控等重要細胞活動，具有激活NFκB、抗細胞凋亡、啟動轉錄因子及促進細胞增殖、浸潤等作用[1-2]。

p97蛋白在許多泛素化依賴的過程中扮演著中心分子的角色[3-4]。在內質網（ER）相關的降解過程中的p97分子功能研究得最清楚[5]。ER中錯誤折疊的蛋白被轉移至細胞膜的胞質側，并在此進行泛素化修飾。p97與其輔因子UFD1-NPL4形成復合物，之后與泛素化蛋白結合，并且將它們從質膜上提取出來以促進其向蛋白酶體的傳送。同樣，p97-UFD1-NPL4復合物也介導多聚泛素蛋白從染色質中分離出來，在某些情況下這些蛋白也被轉移至蛋白酶體[5-6]。在調控轉錄、DNA損傷應答及細胞周期過程中，p97-Ufd1-Npl4的染色質相關活性至關重要，是維持增殖細胞基因穩定性的必需物[7-8]。

除了p97-UFD1-NPL4之外，p97還能與具有其他細胞功能的輔因子形成復合物[5,9]。這些輔因子大都含有UBX或UBX樣的泛素化折疊結構域，可調節其與p97蛋白的結合[10]。p97與含有UBX結構域（包括p47或其同源物p37）結合成復合物，指導有絲分裂和調控高爾基體的改造[11]。p97-p47依賴的反應是泛素依賴性的，并且需要p47的泛素結合結構域和去泛素化酶VCIP135的存在[12]。雖然迄今泛素化的靶標仍未確定，但依然表明p97在這些過程中“管理”著一個重要的調控步驟[13]。此外，近年來許多研究將p97與膜介導的胞內運輸和自噬聯系在一起。有趣的是，這2條途徑不是通過蛋白酶體而是通過向溶酶體運送物質進行降解。

1 胞內運輸及其泛素化調控

細胞的內吞作用受許多不同機制的調控[14-15]。細胞外的物質和部分質膜蛋白被攝取進入細胞內小泡進而形成早期的胞內體，之后膜蛋白或者被質膜回收再利用，或者被運送至晚期的胞內體和溶酶體進行降解[16]。目前，研究最深的是網格蛋白介導的內吞作用[17]。以復雜的信號傳遞事件開始，可溶的成分（包括網格蛋白）在細胞膜的胞質側形成一個膜外套以及集中要運輸的“貨物”。此外，還有窖蛋白（caveolin，Cav）-1及Cav-1的同系物介導的胞內運輸[18-19]。與網格蛋白相反，Cav-1是一種具有能夠插入質膜的胞質小葉的發夾狀結構膜蛋白，細胞膜內陷形成胞膜窖（caveolae）。

研究表明，內吞小泡融合形成早期的胞內體是受小GTP酶Rab5和它的效應器，如早期胞內抗原（EEA1）調控的[20-21]。招募的分子運至胞內體膜后，能夠與Rab5效應蛋白、Rabaptin-5、Rabex-5及膜融合因子NSF裝配成大分子復合物[22]。Rab5也能招募磷脂酰肌醇-3激酶Vps34/p150，從而標記早期的胞內體。在成熟至晚期的胞內體過程中，Rab5被Rab7替換[16]。

轉運必需內吞體分選復合物（endosomal sort?ing complex required for transport，ESCRT）是指一系列的四蛋白復合物（ESCRT-0至ESCRT-Ⅲ），跨膜蛋白從胞內體向溶酶體的選擇性運輸過程受ES?CRT蛋白復合物調節[23-24]。ESCRT復合物的連續能夠激活調節綁定物質的濃度、胞內小泡的形成以及將物質分揀至這些小泡，最后ESCRT復合物組分ATP酶超家族的VPS4回收再利用[25-26]。胞內體膜結合之后形成的細胞器，也就是我們所說的多泡體，在細胞核的周圍與溶酶體融合之后，囊泡的脂質和蛋白質組分被酸性水解酶降解[27]。其中糖蛋白LAMP1仍然留在膜上，成為晚期胞內體或溶酶體的標記物。

不管是內吞作用還是多泡體的形成都涉及高度調控及蛋白質相互作用。以單泛素、多泛素或短賴氨酸63連接的多聚泛肽鏈等形式的泛素修飾，在物質分選和調控分選機器中扮演重要角色[28]。在質膜上物質的泛素化起內化信號（如epsin或EPS15）的作用。然而，分選機器的組分包括epsin本身也被泛素化，進而參與蛋白質與蛋白質的相互作用[29]。總之，泛素化的動態性和泛素管理的相互作用網絡受到特殊的泛素連接酶和去泛素化酶的調控[30]。

2 VCP/p97在胞吞途徑中的作用

上世紀90年代，Pleasure等首次發現p97參與內吞作用，并與內吞小泡膜組件蛋白相互作用[31]。然而，p97對內吞作用功能性的影響及其與內吞轉運的關系仍待進一步的研究。2011年，Ramanathan和Ritz分別在自己的研究中揭示了p97與內吞作用的新聯系，又一次證明了p97與胞吞途徑的組分發生物理作用[32-33]。

p97在胞吞途徑的一些步驟中扮演著什么樣的角色？它的功能是什么？已證明在各種途徑中p97能夠提取泛素修飾的靶蛋白[3-4]；相反，泛素化廣泛參與胞吞途徑不但擔任著“貨物”蛋白分選信號的功能，還調節著內吞機器的活性和相互作用[28]。同樣，Carvalho等認為p97可能不僅在ER相關的降解過程中直接綁定和提取泛素化底物，而且還可能在結構上改造運輸機器以提高底物的運輸效率[34]。然而迄今的研究數據表明，p97在胞內體中的作用是非蛋白酶體依賴性的，但并不完全排除蛋白酶體的參與。也有報道稱交叉遞呈過程中，胞內體中底物多聚泛素化會招募p97，將底物提取出來運送至蛋白酶體，并在此進行抗原遞呈處理[35]。

此外，p97參與胞內運輸也有醫學相關性。p97點突變造成顯性遺傳累及多系統的退行性疾病，稱為包涵體肌病與Paget骨和額顳癡呆（inclusion body myopathy with Paget's disease of bone and fronto-temporal dementia，IBMPFD）[36-37]。值得注意的是，疾病相關的突變特異性地廢除了p97與其輔因子如UBXD1的相互作用，但對UFD1-NPL4或p47無效[33,38]，同時也影響了Cav-1的綁定[33]。這表明，細胞內吞作用缺陷可能有助于該疾病發病機理的研究。同時，雖然ER相關的降解并沒有受損，但自噬也受到疾病相關的p97突變的影響[32,39]。提示p97與自噬的功能和胞內運輸有一定的聯系。

3 自噬中的VCP與胞內運輸潛在的聯系

自噬是降解大分子結構如細胞器和蛋白聚集物的過程。自噬起始于雙層膜的形成，該雙層膜是由泛素樣蛋白LC3（LC3-Ⅱ）的脂類形式標記，之后吞噬細胞組分形成自噬體。根據降解的物質不同，可將自噬分為大自噬、核糖體自噬、線粒體自噬及微自噬[40-43]。在許多情況下要降解的物質與泛素結合，在自噬體膜上通過特殊的銜接蛋白p62和NBR1與LC3-Ⅱ銜接起來[44]。自噬體最終與溶酶體結合，對大分子物質進行降解[45]。

Ju等在p97相關疾病IBMPFD中首次揭示p97參與自噬過程。他們發現病人組織切片中富含泛素和自噬標志蛋白p62及LC3B的泡狀結構[46]，在表達疾病相關的p97轉基因小鼠及組織培養的細胞（p97突變或siRNA干擾p97缺陷）中也得到驗證[47-48]。目前已有許多研究表明p97在自噬中的作用[49]。Weihl等發現在p97缺乏時自噬體和溶酶體的融合受到抑制[46]；Taylor等發現，組織蛋白酶D陽性的自噬體中，p97只在自噬體和溶酶體融合之后發揮作用[39]。與哺乳類動物相比，酵母菌的p97同系物Cdc48及其輔因子Shp1（哺乳動物p47的同系物）是自噬體形成過程中所必需的，同時在自噬過程中Shp1和Atg8（LC3的同系物）可以直接相互作用[50]。此外，在核糖體自噬過程中去泛素化的復合物UBP3-BRE5通過與p97及其輔因子UFD3形成三重復合物，從而扮演著十分關鍵的角色[51]。然而在線粒體自噬過程中可能存在不同的機制。有文獻表明，p97幫助蛋白酶體依賴的線粒體融合蛋白降解[52]。從酵母菌中獲得的數據也表明，細胞核的零碎微自噬需要Cdc48及其輔因子Shp1的存在[53]。總之，細胞核周圍聚集體的形成及聚集蛋白的清除，也是p97的重要功能之一。

4 結語

越來越多的資料已顯示p97參與了胞內運輸和自噬，現在最重要的是理解在這些細胞過程中p97的基礎分子機制。此外，p97可能參與形成更大的功能復合物，諸如膜錨定的招募因子、泛素連接酶、去泛素化酶等。對p97更深入的研究分析將有助于理解這些細胞進程。

[1]Dai R M,Li C C.Valosin-containing protein is a multi-ubiq?uitin chain-targeting factor required in ubiquitin-proteasome degradation[J].Nat Cell Biol,2001,3(8):740-744.

[2]Dai R M,Chen E,Longo D L,et al.Involvement of valosincontaining protein，an ATPase co-purified with IkappaBatpha and 26S proteasome，in ubiquitin-proteasome-mediated degra?dation of IkappaBalpha[J].J Biol Chem,1998,273(6):3562-3573.

[3]Meyer H,Bug M,Bremer S.Emerging functions of the VCP/p97 AAA ATPase in the ubiquitin system[J].Nat Cell Biol,2012,14(2):117-123.

[4]Ye Y.Diverse functions with a common regulator:ubiquitin takes command of an AAA ATPase[J].J Struct Biol,2006,156(1):29-40.

[5]Stolz A,Hilt W,Buchberger A,et al.Cdc48:a power ma?chine in protein degradation[J].Trends Biochem,Sci,2011,36(10):515-523.

[6]Yamanaka K,Sasagawa Y,Ogura T.Recent advances in p97/VCP/Cdc48 cellular functions[J].Biochim Biophys Acta,2012,1823(1):130-137.

[7]Chapman E,Fry A N,Kang M.The complexities of p97 func?tion in healthand disease[J].Mol Biosyst,2011,7(3):700-710.

[8]Haines D S.P97-containing complexes in proliferation control and cancer:emerging culprits or guilt by association[J]?Genes Cancer,2010,1(7):753-763.

[9]Alexandru G,Graumann J,Smith G T,et al.UBXD7 binds multiple ubiquitin ligases and implicates p97 in HIF1alpha turnover[J].Cell,2008,134(5):804-816.

[10]Schuberth C,Buchberger A.UBX domain proteins:major regu?lators of the AAA ATPase Cdc48/p97[J].Cell Mol Life Sci,2008,65(15):2360-2371.

[11]Uchiyama K,Kondo H.P97/p47-mediated biogenesis of Golgi and ER[J].J Biochem(Tokyo),2005,137(2):115-119.

[12]Wang Y,Satoh A,Warren G,et al.VCIP135 acts as a deu?biquitinating enzyme during p97-p47-mediated reassembly of mitotic Golgi fragments[J].J Cell Biol,2004,164(7):973-978.

[13]Meyer H H.Golgi reassembly after mitosis:the AAA family meets the ubiquitin family[J].Biochim Biophys Acta,2005,1744(3):481-492.

[14]Doherty G J,McMahon H T.Mechanisms of endocytosis[J].Annu Rev Biochem,2009,78:857-902.

[15]Mercer J,Schelhaas M,Helenius A.Virus entry by endocyto?sis[J].Annu Rev Biochem,2010,79:803-833.

[16]HuotariJ,HeleniusA.Endosomematuration[J].EMBO J,2011,30(17):3481-3500.

[17]McMahon H T,Boucrot E.Molecular mechanism and physio?logical functions of clathrin-mediated endocytosis[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2011,12(8):517-533.

[18]Mayor S,Pagano R E.Pathways of clathrin-independent endo?cytosis[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2007,8(8):603-612.

[19]Parton R G,Simons K.The multiple faces of caveolae[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2007,8(3):185-194.

[20]Mills I G,Jones A T,Clague M J.Involvement of the endo?somal autoantigen EEA1 in homotypic fusion of early endo?somes[J].Curr Biol,1998,8(15):881-884.

[21]Zerial M,McBride H.Rab proteins as membrane organizers[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2001,2(2):107-117.

[22]McBride H M,Rybin V,Murphy C,et al.Oligomeric com?plexes link Rab5 effectors with NSF and drive membrane fu?sion via interactions between EEA1 and syntaxin 13[J].Cell,1999,98(3):377-386.

[23]Hurley J H,Emr S D.The ESCRT complexes:structure and mechanism of a membrane-trafficking network[J].Annu Rev Biophys Biomol Struct,2006,35:277-298.

[24]Raiborg C,Stenmark H.The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins[J].Nature,2009,458(7237):445-452.

[25]Gruenberg J,Stenmark H.The biogenesis of multivesicular en?dosomes[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2004,5(4):317-323.

[26]van Meel E,Klumperman J.Imaging and imagination:under?standing the endo-lysosomal system[J].Histochem Cell Biol,2008,129(3):253-266.

[27]Luzio J P,Pryor P R,Bright N A.Lysosomes:fusion and function[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2007,8(8):622-632.

[28]Sigismund S,Polo S,Di Fiore P P.Signaling through monou?biquitination[J].Curr Top Microbiol Immunol,2004,286:149-185.

[29]Polo S,Sigismund S,Faretta M,et al.A single motif responsi?ble for ubiquitin recognition and monoubiquitination in endo?cytic proteins[J].Nature,2002,416(6879):451-455.

[30]Clague M J,Urbé S.Endocytosis:the DUB version[J].Trends Cell Biol,2006,16(11):551-559.

[31]Pleasure I T,Black M M,Keen J H.Valosin-containing pro?tein,VCP,is a ubiquitousclathrin-binding protein[J].Nature,1993,365(6445):459-462.

[32]Ramanathan H N,Ye Y.The p97 ATPase associates with EEA1 to regulate the size of early endosomes[J].Cell Res,2012,22(2):346-359.

[33]Ritz D,Vuk M,Kirchner P,et al.Endolysosomal sorting of ubiquitinated caveolin-1 is regulated by VCP/p97 and UBXD1 and impaired by VCP disease mutations[J].Nat Cell Biol,2011,13(9):1116-1123.

[34]Carvalho P,Stanley A M,Rapoport T A.Retrotranslocation of a misfoldedluminal ER protein by the ubiquitin-ligase Hrd1p[J].Cell,2010,143(4):579-591.

[35]Zehner M,Chasan A I,Schuette V,et al.Mannose receptor polyubiquitination regulates endosomal recruitment of p97 and cytosolic antigen translocation for cross-presentation[J].Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(24):9933-9938.

[36]Kimonis V E,Fulchiero E,Vesa J,et al.VCP disease associ?ated with myopathy,Paget disease of bone and frontotemporal dementia:review of a unique disorder[J].Biochim Biophys Ac?ta,2008,1782(12):744-748.

[37]Weihl C C,Pestronk A,Kimonis V E.Valosin-containing pro?tein disease:inclusion body myopathy with Paget's disease of the bone and fronto-temporal dementia[J].Neuromuscul Disord,2009,19(5):308-315.

[38]Fernández-Sáiz V,Buchberger A.Imbalances in p97 co-fac?tor interactions in human proteinopathy[J].EMBO Rep,2010,11(6):479-485.

[39]Tresse E,Salomons F A,Vesa J,et al.VCP/p97 is essential formaturation ofubiquitin-containing autophagosomes and this function is impaired by mutations that cause IBMPFD[J].Autophagy,2010,6(2):217-227.

[40]Bernales S,Schuck S,Walter P.ER-phagy:selective autopha?gy of the endoplasmic reticulum[J].Autophagy,2007,3(3):285-287.

[41]Kim I,Rodriguez-Enriquez S,Lemasters J J.Selective degra?dation of mitochondria by mitophagy[J].Arch Biochem Bio?phys,2007,462(2):245-253.

[42]Kraft C,Peter M,Hofmann K.Selective autophagy:ubiquitinmediated recognition and beyond[J].Nat Cell Biol,2010,12(9):836-841.

[43]Kvam E,Goldfarb D S.Nucleus-vacuole junctions and piece?meal microautophagy of the nucleus in S.cerevisiae[J].Au?tophagy,2007,3(2):85-92.

[44]Kirkin V,McEwan D G,Novak I,et al.A role for ubiquitin in selective autophagy[J].Mol Cell,2009,34(3):259-269.

[45]Weidberg H,Shvets E,Elazar Z.Biogenesis and cargo selec?tivity of autophagosomes[J].Annu Rev Biochem,2011,80:125-156.

[46]Ju J S,Fuentealba R A,Miller S E,et al.Valosin-contain?ing protein(VCP)is required for autophagy and is disrupted in VCP disease[J].J Cell Biol,2009,187(6):875-888.

[47]Badadani M,Nalbandian A,Watts G D,et al.VCP associat?ed inclusion body myopathy and paget disease of bone knockin mouse model exhibits tissue pathology typical of human disease[J].PLoS One,2010,5(10):e13183.

[48]Custer S K,Neumann M,Lu H,et al.Transgenic miceex?pressing mutant forms VCP/p97 recapitulate the full spectrum of IBMPFD including degeneration in muscle,brain and bone[J].Hum Mol Genet,2010,19(9):1741-1755.

[49]Dargemont C,Ossareh-Nazari B.Cdc48/p97,a key actor in the interplay between autophagy and ubiquitin/proteasome cata?bolicpathways[J].Biochim BiophysActa,2012,1823(1):138-144.

[50]Krick R,Bremer S,Welter E,et al.Cdc48/p97 and Shp1/p47 regulate autophagosome biogenesis in concert with ubiqui?tinlike Atg8[J].J Cell Biol,2010,190(6):965-973.

[51]Ossareh-Nazari B,Bonizec M,Cohen M,et al.Cdc48 and Ufd3,new partners of the ubiquitin protease Ubp3,are re?quired for ribophagy[J].EMBO Rep,2010,11(7):548-554.

[52]Tanaka A,Cleland M M,Xu S,et al.Proteasome and p97 mediate mitophagy and degradation of mitofusins induced by Parkin[J].J Cell Biol,2010,191(7):1367-1380.

[53]Rusten T E,Stenmark H.How do ESCRT proteins control au?tophagy[J]?J Cell Sci,2009,122:2179-2183.