微生物細胞色素P450與膽固醇的生物代謝

馬婧，楊秀清，曾令丹，魏玲

山西大學 生物技術研究所，山西 太原 030006

1 細胞色素P450概述

細胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）是一個含鐵血紅素和硫羥基的單加氧酶蛋白超家族，能在溫和條件下把底物中反應惰性的碳氫鍵氧化，從而使底物發生氧化。CYP450廣泛分布在動物、植物、低等真核生物和細菌體內，在同種生物的不同組織中都存在，是自然界中含量最豐富、底物譜最廣的催化酶系。

CYP450是以硫醇鹽結合血紅素為活性中心催化氧原子轉移的氧化還原酶，氧需由亞鐵血紅素（HEM）來活化。位于活性中心（HEM）的鐵離子一邊和半胱氨酸的硫絡合，另一邊和水的氧分子絡合。CYP450中絕對保守的半胱氨酸殘基與催化活性中心亞鐵血紅素中鐵元素形成硫醇鹽離子鍵，成為鐵的一個配體[1]。這正是CYP450中的鐵能與一氧化碳絡合，并在450 nm存在特征吸收的原因，最初名稱也由此而來[2]。

CYP450參與生物體內多種外源物質的代謝和內源物質的轉化，如甾類激素、膽汁酸、藥物、膽固醇、脂肪酸、毒素、前致癌劑等的生物代謝等，特別是在許多臨床藥物代謝中具有重要的生物學意義。

CYP450單加氧酶系是自然界中最具催化多樣性的生物催化劑，可以催化的反應主要有：烷基的氧化、環氧化、羥基化，氧、硫、氨部位的脫烷基化，氨部位的羥基化和氧化，硫部位的氧化，氧化性脫氫、脫氨和脫鹵素，氧化性的C-C鍵斷裂，以及一些還原催化反應[3]。人類制造的藥物、環境化合物等，大多是CYP450的可能底物，所以，多數CYP450酶都具有很寬的底物譜。

1.1 CYP450的命名及分類

目前，被命名的CYP450基因序列超過1萬個，可根據氨基酸序列的同一性高低分類：氨基酸序列的同一性＞40%屬于同一個家族（用阿拉伯數字表示），＞55%屬于同一個亞家族（用大寫英文字母表示），如CYP450 6C8、CYP450 76A3、CYP450 125B2等。CYP450 125B2，即CYP450第125個家族B亞族中第2個成員，通常可簡寫為CYP125B2。

根據催化反應中電子傳遞鏈的不同，即催化機制的不同，可將CYP450分為4種類型：Ⅰ類位于細菌及真核生物線粒體膜上，這類CYP450要求鐵氧化還原蛋白和鐵硫蛋白參與電子鏈的傳遞；Ⅱ類結合于內質網上，由核黃素單核苷酸參與電子鏈的傳遞，直接與其還原酶作用；Ⅲ類與其還原酶融合成一個多肽，從底物直接接受電子；Ⅳ類則從煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）接受電子[4]。

1.2 CYP450的應用

CYP450被稱為萬能生物催化劑，由于其極強的催化能力、能催化多種類型的化學反應及對氧化位點的高度選擇性等多方面的優勢，引起化學、生物學、藥學、環境學等眾多領域研究者的興趣。目前發現的人類CYP450酶有57種，約90%的臨床藥物都通過這些CYP450酶的代謝，這使得研究CYP450與藥物代謝的作用很受重視。因此，CYP450在生物學和藥學方面的應用更為突出。

1.2.1 藥物設計及基因治療 CYP450被廣泛用于藥物的前藥設計和癌癥的基因治療方面。由于一些藥物代謝的穩定性、細胞毒性，以及某些藥物須在特定部位、或須長時間發揮藥效等，藥物需要被制成前藥形式，經生物體內轉化后發揮其功能。如被CYP450激活的環磷酰胺能明顯抑制腫瘤增殖，并能很好地避免藥物毒性[5]；降壓藥氯沙坦需要CYP2C9和CYP3A4的參與，在生物體內轉化為E-3174后才能發揮療效；而CYP2C19則參與抗瘧藥氯胍，代謝成環氯胍，發揮抗瘧作用。

1.2.2 新藥物靶標 由于CYP450一些特異的催化反應而成為新藥開發的作用靶標。如治療乳腺癌細胞增殖的關鍵在于減少雌激素的生成，而抑制CYP19A的催化活性可有效減少雌激素的轉化，成為治療乳腺癌的新途徑，目前已有多個CYP19A的抑制劑藥物應用于臨床[6]；再如，抗真菌藥物的靶標CYP51、戒煙類藥物開發的潛在靶標CYP2A6等。

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1.2.3 藥物先導物檢測 在藥物研發早期，CYP450被用來檢測藥物先導物的代謝性質，這樣既可以提高藥效，縮短藥物研發周期，節約研發成本，也避免了可能的藥物-藥物間相互作用，而且可以根據檢測來對藥物進行定向改造和結構優化，以提高藥物代謝穩定性和生物利用率，并且也能降低藥物的毒性。

當然，CYP450還可用于化工領域，作為化工原料和化學中間體。如CYP2A6就是一個催化氧化吲哚成為靛藍的非常好的催化劑[7]。CYP450也可用于環境監測和保護中，作為環境污染的指示劑，利用污染物濃度對CYP450酶活性（抑制或誘導）的定量關系來檢測環境污染的程度，判斷環境狀況。CYP450還能代謝多環芳烴及多鹵代物等難降解的環境污染物，在生物除污、生物凈化等方面也具有重要意義[8]。

2 膽固醇及其微生物代謝研究

膽固醇又稱膽甾醇，是一種環戊烷多氫菲的衍生物，是自然界存在最豐富的甾醇化合物，廣泛存在于動物體內，特別是哺乳動物如人體內，尤以腦及神經組織中最為豐富，在腎、脾、皮膚、肝和膽汁中的含量也高，是人類重要的脂類物質之一。膽固醇還是膜、血漿脂蛋白的重要組成成分，是許多具有特殊生物活性物質，如膽汁酸、類固醇激素、維生素D3等的前體之一。

盡管膽固醇在人體內有著廣泛的生理作用，但當其積累過量時便會導致高膽固醇血癥、動脈粥樣硬化、靜脈血栓等疾病的發生，會對機體產生不利的影響。此外，血清膽固醇水平的提高也是引發冠心病的主要危險因素之一。因此，近年來對膽固醇的代謝和調控的研究也日益增多。

關于膽固醇代謝的報道大多是人體的CYP450降膽固醇的體外和體內研究進展。關于微生物代謝膽固醇的研究相對較少。但隨著微生物代謝膽固醇的優勢日漸突出，越來越多的研究者將目光集中到微生物代謝上來。

微生物代謝膽固醇的途徑很多。據報道，某些益生菌的主要益生功能之一便是降解膽固醇。一系列體外研究提出了益生菌降膽固醇的可能機理，主要包括：游離膽酸鹽與膽固醇的共沉淀作用，細菌的酶對膽酸鹽的去結合作用，膽固醇在細菌細胞膜或壁上的結合，細菌對膽固醇的吸收、共沉淀作用的同時發生等。但是，目前益生菌去除膽固醇的機理并沒有定論，益生菌在人體內作用的機理報道更少，臨床研究存在樣本小、服用劑量大、實驗期限短、降膽固醇效果不穩定等問題，因此進一步的研究將集中于相關機理和臨床研究上[9]。

鑒于上述原因，研究人員又針對微生物CYP450代謝膽固醇的催化途徑進行了深入探討。目前，微生物對甾醇的降解在諾卡菌、分枝桿菌和紅球菌中的某些菌株中的研究已達到生化分子水平。研究顯示，微生物降解膽固醇包括膽固醇的側鏈降解和固醇環的打開兩個過程，但這兩個過程的先后次序尚未明了，而且在不同物種間也有所不同。通常，膽固醇3β-羥基部分氧化和Δ5異構化生成Δ4被認為是是膽固醇降解的開始。這種轉化是由膽固醇氧化酶或3β-類固醇脫氫酶催化完成的，生成4-膽甾烯-3-酮；而后，4-膽甾烯-3-酮進一步轉化，發生側鏈C26的羥基化，從而引起膽固醇側鏈的降解，或環A環B的氧化，生成2-六羥基-2，4-二烯-羧基酸；最后，C26-羧基酸進一步氧化，生成C22-羧基酸中間體、丙酰-CoA和乙酰-CoA[10]。可見，在膽固醇代謝過程中，中間體4-膽甾烯3-酮的C26羥基化對整個降解途徑起到關鍵作用，而催化這一關鍵步驟的酶便是CYP450家族的CYP450 125（CYP125）。

3 CYP125在微生物代謝膽固醇中的關鍵作用

3.1 結核分枝桿菌中CYP125代謝膽固醇

隨著基因組測序的發展，人們發現的CYP種類也越來越多，迄今細菌中己有900種CYP450被鑒定，其中部分物種的CYP450數量己明確。典型的放線菌基因組包括20種CYP450的編碼基因，可編碼多種CYP450。如恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis MC2 155）中有 39種CYP450，結核分枝桿菌（M.tuberculosis H37Rv）中有20種CYP450。在眾多CYP450中，CYP125對膽固醇代謝的起始起到關鍵作用。

CYP125在結核分枝桿菌中的編碼基因屬于膽固醇降解基因簇的一部分[11]。編碼膽固醇降解的基因簇在一些放線菌中是保守序列，包括非致病性的土壤細菌紅球菌Rhodococcus jostii RHA1。該基因簇的功能表達需要膽固醇（底物）的介入，而后負責降解甾醇側鏈，或環A和環B[12-13]。對膽固醇吸收和分解的動物感染和缺失突變研究顯示，膽固醇的生物代謝對結核分枝桿菌的傳播和耐藥性都具有十分關鍵的作用[14-16]，并且在小鼠和巨噬細胞等模式生物中也得到了類似的結果，這表明結核分枝桿菌的致病性與膽固醇的生物代謝有很大的相關性[17-18]。

資料顯示，CYP125雖與結核分枝桿菌的體內存活相關，而且它的分解代謝的催化活性已被證實，但它的生理學功能尚未明了，于是研究者進行了一系列實驗。首先，以卡介苗（BCG）為模式生物與結核分枝桿菌的膽固醇代謝基因簇進行了比較；然后，對結核分枝桿菌H37Rv中CYP125基因進行了工程菌的異源表達，對得到的蛋白進行了分離純化，并且通過氣質聯用等方法對CYP125酶的活性及性質進行了測定；最終得出CYP125參與催化了膽固醇代謝途徑的起始步驟。

實驗表明，CYP450催化膽固醇的降解主要是催化烷烴C-H鍵的羥基化及芳香環的氧化；CYP125是作為一類C26-羥基酶，通過對膽固醇側鏈C26位的羥基化來起始膽固醇分解代謝的[10]。結核分枝桿菌CYP450在膽固醇代謝中的主要功能有：膽固醇的飽和側鏈在進入結核分枝桿菌（β-氧化途徑）前一定被化學功能化修飾，為β-氧化反應氧化側鏈做準備，而后至少有4個階段是必要的[19-20]。在前3個階段，膽固醇的側鏈被CYP450酶有序地催化氧化成末端醇、醛和酸。有3種結核分枝桿菌CYP450酶，即CYP125（Rv3545c）、CYP142（Rv3518c）和 CYP124（Rv2266）參與催化氧化膽固醇和4-膽甾烯-3-酮的側鏈。最后，ATP-依賴階段，通過固醇-CoA連接酶催化完成[21]。

3.2 紅球菌中CYP125代謝膽固醇

在原核微生物對CYP450代謝膽固醇的催化途徑方面，結核分枝桿菌屬的研究居多，如今紅球菌也加入到研究行列當中，如Rhodococcus DSM43269和R.jostii RHA1等。基因組序列數據分析表明，與其他原核生物相比，放線菌擁有相當數量的基因編碼CYP450，如R.jostii RHA1約有29組基因編碼其CYP450，盡管它們中絕大多數的生物功能未知，但其中的一些功能顯示與甾醇類的生物代謝相關。

紫紅紅球菌（R.rhodochrous）DSM43269能在鐵螯合劑的存在下選擇性地降解甾醇側鏈，抑制3-甾酮-9α-羥化酶（KSH）的活性。這種表型在缺乏KSH活性的多基因缺失突變株DSM43269（GR32）中穩定復制。突變菌株GR32完全阻斷了甾醇的環降解，選擇性地降解甾醇側鏈，從而積累1，4-雄甾二烯-3，17-二酮（ADD）等代謝產物[10]。

迄今，參與甾醇側鏈降解的基因尚未確定。在R.jostii RHA1中利用轉錄組學分析發現了一組膽固醇代謝的基因簇，包括2個CYP450編碼基因。有趣的是，RHA1生長在膽固醇基質中時CYP125是一個高度上調基因，這也顯示了這種酶在膽固醇代謝中的重要作用。在RHA1基因組中，CYP125的位置與預測編碼的β-氧化酶的基因相鄰，也就意味著將參與膽固醇的烷基側鏈降解。

同結核分枝桿菌一樣，研究者也構建了紅球菌CYP125的工程菌，經菌體異源表達和蛋白分離純化，再結合膽固醇及其類似物的一些相似性研究，并且經正常株和突變株的實驗，對比得出細菌中膽固醇分解代謝的起始是側鏈的氧化，而不是環的氧化。此外，CYP125在紅球菌中也作為一種甾醇C26位的單加氧酶，參與了4-膽甾烯-3酮側鏈的羥基化，即參與了膽固醇的起始代謝，是微生物體內膽固醇代謝的關鍵酶之一。

4 展望

CYP450單加氧酶引發研究者的極大興趣在于它極強的生物催化能力，并參與眾多生理生化過程，也在于它獨特的催化作用機制，即將分子氧斷裂并將其中一個氧原子插入底物。如前所述，CYP450這種獨特的反應酶可應用于很多領域中。

自發現CYP450酶始，人們就開始嘗試將各種具有特殊催化活性的CYP450異源表達于大腸桿菌等模式生物中，或通過傳統的選育和細胞培養技術使CYP450酶可以用于生物氧化催化生產中。目前來說這2種方法都相當有效。但是有時由于動植物細胞培養困難，或野生型CYP450的表達量低、活力差等原因，很難直接應用到工業化生產領域，故需要對CYP450酶進行適當改造，如針對CYP450酶本身的改造、整個酶系統的雜交或重組、輔因子NAD（P）H循環系統效率的改善等。

我們已經知道，CYP450催化的藥物生物轉化是藥物代謝中最重要的一個進程，該家族共有50多種同工酶，參與代謝90%以上人類常用藥物。因此，細胞色素CYP450催化反應的機理的研究對制藥行業有重大意義。絕大部分藥物對人體而言都是異源體，最終都不能存在于人體內。在掌握CYP450介導的藥物轉化代謝途徑后，可將CYP450用作藥物靶標，有針對性地進行新藥開發、劑型設計，以促進它們在體內快速代謝，這對臨床用藥方案的合理制定具有十分重要的指導意義。

CYP450作為生物界的“新寵兒”，其催化反應的條件、類型、機制等都已得到了廣泛研究，但還有很多未知的挑戰和頗具爭議的難題擺在人們面前。對CYP450催化反應的研究還可以更深刻、更進一步，以便于能更好地對其生理活動進行調控，使其物盡其用，發揮最大的優勢來造福我們的生活。

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