蛋白質組學在疾病研究中的應用

林虹君，張愛紅，李高偉，吉會海，周學志

1.空軍防化大隊，北京 102206；2.防化學院，北京 102205

1984年Wilkins和Williams首先提出蛋白質組（proteome）的概念[1]，即一個基因組在特定時刻表達的全部蛋白質。蛋白質組學（proteomics）是一門以蛋白質組為研究對象，以全面的蛋白質性質研究為基礎，在蛋白質水平對疾病機理、細胞模式、功能聯系等方面進行探討的科學。目前蛋白質組學的研究主要依賴三大技術：蛋白質分離技術、質譜技術和生物信息學。

1 蛋白質組學及主要技術

1.1 雙向凝膠電泳技術（two dimensional polyacryl?amide gel electrophoresis，2D-PAGE）[2]

2D技術是目前蛋白質分離的主要技術。第一向電泳利用固相pH值梯度（immobilized pH gradi?ent，IPG）膠條進行等電點聚焦電泳，將不同等電點的蛋白質分離；第二向在第一向的垂直方向進行SDS-PAGE，從而將蛋白質根據其等電點和相對分子質量的差異在凝膠上分離成獨立的蛋白質點。為避免不同凝膠之間的差異對結果分析帶來的困難，發展了差異凝膠電泳技術（differential in-gel elec?trophoresis），將不同蛋白樣品用不同激發波長的熒光標記后，在同一塊膠上進行分離，保證了實驗條件的一致性，有利于差異表達點的篩選。

1.2 質譜技術（mass spectrometry，MS）[3-4]

質譜技術是蛋白質組學的核心技術。將感興趣的蛋白質點從凝膠上切下后，進行膠內酶切，將蛋白質降解為多肽片段，通過基質輔助激光解吸電離（matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI）或電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）技術使樣品分子離子化，根據不同離子間的質荷比（m/z）的差異來分離并確定相對分子質量。在蛋白質組學中，目前最為常用的質譜分析系統包括兩大類，即以單一質譜為基礎的和以串聯質譜為基礎的。以單一質譜為基礎的質譜分析系統以MALDI-TOF MS為代表，串聯質譜以ESI-MS MS為代表。

MALDI-TOF MS[5-7]是將作為離子源的MALDI和分析檢測飛行時間質譜連用。用一定波長的激光打在樣品上，使樣品離子化，然后在電場力作用下飛行，通過檢測離子的飛行時間計算出其質量電荷比，從而得到一系列酶解肽段的分子質量或部分肽序列等數據，最后通過相應的數據庫搜索來鑒定蛋白質。該技術精度高、分析時間短，可同時處理許多樣品，是高通量鑒定的首選方法，常用于蛋白質的肽指紋圖譜（peptide mass fingerprinting，PMF）鑒定。ESI-MS MS[8-10]是在噴射過程中利用電場完成多肽樣品的離子化，離子化的肽段轉移進入質量分析儀，根據不同離子的質荷比差異分離，并確定分子質量。用此法分析肽混合物、鑒定蛋白質時，可對每一肽段進行序列分析，綜合MS數據鑒定蛋白質，大大提高了鑒定的準確度。ESI-MS MS可檢測出飛摩爾（fmol）數量級的樣品，精確度可達0.005%。質譜還可用于翻譯后修飾分析，如磷酸化、糖基化等。

1.3 生物信息學（bioinformatics）

生物信息學是生物學與計算機技術、應用數學、網絡技術等結合建構起來的一門新興學科[11-12]。它將大量系統的生物學數據與數學和計算機科學的分析理論和實用工具聯系起來，通過對生物學實驗數據的獲取、加工、存儲、檢索與分析，達到解釋數據所蘊含的生物學意義的目的。生物信息學在蛋白質組學研究中的作用主要有兩個方面：一是分析和構建雙向電泳數據庫、蛋白質質譜分析數據；二是搜索與構建蛋白質組數據庫。隨著蛋白質組研究的推廣，全球建立的與蛋白質相關的數據越來越多。已經建立的如Medline、PDB等數據庫，包括了人血漿、尿液、腦脊液、正常組織和腫瘤組織及各種微生物的蛋白質圖譜。生物信息學是蛋白質組學技術的重要組成部分，Swissprot是世界上使用最廣泛的蛋白質序列數據庫，能提供多種蛋白質數據，如蛋白質功能、結構域結構、翻譯后修飾等。質譜鑒定得到的有關蛋白質數據，可以通過軟件在數據庫中查找匹配的可能蛋白質。

2 蛋白質組在疾病研究中的應用

蛋白質組學的發展對于疾病的研究非常及時，對蛋白質結構和功能的研究將直接闡明疾病在生理或病理條件下的變化機制。

2.1 蛋白質組學技術在心血管疾病研究中的應用[13]

心臟蛋白質組學研究主要涉及心肌病、心臟衰竭、心肌缺血、慢性應激、心臟衰老等。心肌病尤其是擴張型心肌病蛋白質組學研究最受關注，主要是分析病變心肌與正常心肌組織或細胞的差異蛋白質組，包括肌球蛋白輕鏈2（MLC2）、結合蛋白等細胞骨架蛋白，ATP合成酶、肌酸激酶、泛素C端水解酶等與線粒體能量產生相關蛋白，及熱激蛋白HSP60、HSP70等應激相關蛋白。對心肌缺血保護機制的研究主要集中于對蛋白激酶C（PKC）功能蛋白質組學的探討。應用蛋白質組學技術研究心臟衰老保護機制的性別差異，發現心臟中糖酵解和線粒體的代謝改變可能是心肌衰老的機制。慢性抑制應激狀態可誘發心功能不全及心肌病，應用2DE-MS探討與應激損傷有關的線粒體蛋白，發現慢性抑制應激狀態的心肌線粒體與對照組相比有11個差異蛋白點，鑒定出5個蛋白表達減少，且與Krebs循環和脂質代謝有關。

2.2 蛋白質組學技術在肝病研究中的應用[14-16]

由于蛋白質組學研究更接近生命現象的本質，并在藥靶研究中具有潛在價值，所以已被廣泛用于疾病相關研究。在肝臟研究領域，蛋白質組學可用來研究肝臟的生理與病理、肝臟發育及肝臟疾病等，主要肝臟疾病包括肝臟腫瘤，肝硬化，毒、藥物肝損傷等。肝硬化是一種或多種病因長期或反復作用造成的彌漫性肝臟損傷，其中肝星狀細胞的活化是啟動肝纖維化進程的關鍵環節。受損的肝細胞、鄰近的內皮細胞、枯否細胞及腫瘤細胞和血小板都可激活肝星狀細胞，促其合成大量細胞外基質。因此，肝星狀細胞也成為肝硬化相關的蛋白質組學研究的目標。Kawada等通過對大鼠星狀細胞的蛋白質組分析，發現了一種新蛋白STAP（stellate cellactivationassosiated protein），它只在星狀細胞中被檢測到，在纖維化肝中分離到的體內激活星狀細胞和體外原代培養的活化星狀細胞中高表達，可能通過清除過氧化物發揮抗肝纖維化的作用。

Kristensen等對比了靜態和激活的大鼠肝星狀細胞，發現有27種蛋白在體內和體外激活的星狀細胞中都有相同表達變化，其中鈣周期蛋白、calgizza?rin、半乳糖凝集素1上調，肝羧酸酯酶10、絲氨酸蛋白酶抑制物3下調，還列出了150余種星狀細胞蛋白，從而加深了在蛋白質水平對星狀細胞活化這一肝纖維化關鍵事件的認識。隨著肝臟疾病蛋白質組學研究的不斷深入，將會不斷產生新的和更權威的具有診斷潛能的生物分子靶標，通過分析和監視相應蛋白質的變化，能及時掌握患者病程特點和進展趨勢，對于患者的個體化治療具有重要價值；更有意義的是，早期發現這些預警分子不僅有助于臨床診斷治療肝臟疾病，甚至可以發現患病的高危人群，及早采取相應措施，從而做到防患于未然。

2.3 蛋白質組學在胰腺疾病研究中的應用[17]

胰腺疾病的發生是機體正常細胞在多因素、多基因作用下發生轉變的結果。在這一病變過程中，環境因素或遺傳因素最終都必須通過基因及其相應的蛋白質發揮作用。在人類基因組計劃的推動下，人們在基因水平對胰腺的發生發展進行了廣泛研究，但基因的功能活動最終靠蛋白質體現。蛋白質組學在胰腺疾病研究中常用的樣品為胰腺組織、胰液及血清。樣品處理的好壞是雙向電泳及質譜分析成功與否的關鍵，也是影響分辨率及重復性的主要因素。胰腺是體內含各種蛋白酶最豐富的組織，因此，胰腺組織中的蛋白質組分比其他組織更容易被蛋白酶降解，樣品處理涉及到溶解、變性和還原，從而能去除蛋白質之間的相互作用。標本的采集從活體到離體的時間應盡量短，然后立即置于液氮中或含有蛋白酶抑制劑的緩沖液中。蛋白酶對蛋白質的降解作用很強，并能夠對蛋白質進行化學修飾，易使圖譜中蛋白質點的數量和位置發生改變，因此使用足夠的蛋白酶抑制劑，可使蛋白酶對蛋白質的水解作用的影響減小到最低程度，蛋白酶抑制劑含量比處理其他組織略多，這是保證胰腺蛋白質組分穩定的關鍵步驟。采用2-DE和MALDI-TOF MS測定人體正常胰腺組織蛋白質，共檢測出302種蛋白質，其中27%為具有催化活性與代謝相關的酶類，19%是結構和細胞骨架蛋白，11%是與氧化應激相關的蛋白質，還包括5%熱激蛋白、5%核功能蛋白和4%信號轉導相關蛋白等。其中胰石蛋白、胰腺炎相關蛋白（PAP）僅在胰腺組織中表達，前者的功能與胰腺結石形成有關，PAP的功能不明。另外，通過信號轉導系統蛋白的分析，胰腺的主要信號轉導可能與GTP酶、穿膜受體蛋白、細胞間G蛋白、酪氨酸激酶系統等有關。對正常胰腺2-DE的蛋白質譜分析，可對胰腺組織蛋白質分析的條件進行優化，同時也為胰腺疾病的蛋白質組學研究提供一定的基礎。

作為一種全新的研究手段，蛋白質組學便于在更為全面完整的高度探討胰腺疾病的發病機理和治療機制，為胰腺疾病的早期診斷和有效治療提供有力的理論依據和新思路。但是，目前的研究方法還存在不足之處，如低豐度蛋白質檢測的局限性、血清樣品大分子蛋白質的有效去除、質譜和數據搜索引擎尚不能完整考慮氨基酸的修飾，以及檢測費用昂貴等，這對蛋白質研究提出了新的挑戰。

2.4 蛋白質組學在自身免疫性疾病中的應用[18]

自身免疫性疾病是機體對自身成分發生免疫應答而導致的疾病狀態，可分為器官特異性自身免疫性疾病和全身性自身免疫性疾病。器官特異性自身免疫性疾病患者的病變局限于某一特定的器官，由對器官特異性抗原的免疫應答引起。全身性自身免疫性疾病，又稱系統性自身免疫性疾病，其病變可見于多種器官和組織。自身抗體和（或）自身反應性T淋巴細胞介導的對自身成分發生的獲得性免疫應答是自身免疫性疾病發生的原因。然而，在這些器官特異性和系統性自身免疫性疾病中，大多數疾病的發病機制還不十分清楚。蛋白質組學的出現，為探討自身免疫性疾病的發病機制提供了有力工具。

Ⅰ型糖尿病是一種器官特異性自身免疫性疾病，在遺傳易感性的基礎上，絕大部分胰島B細胞被自身免疫反應所破壞，從而引起胰島素分泌不足與血糖升高。Ⅰ型糖尿病病因不明，發病機制較為復雜，可能與多種因素有關。Purohit等通過SELDITOF技術檢測Ⅰ型糖尿病患者和抗胰島細胞自身抗體陰性的健康者的血清樣本，利用單變量和多變量分析，試圖尋找Ⅰ型糖尿病的標志物，共發現146個具有統計學差異的蛋白峰，為進一步篩選Ⅰ型糖尿病的診斷生物標志物提供了有力的基礎。復發性多發軟骨炎（RP）是一種全身性（系統性）炎癥疾病，發病機制不完全清楚，有學者認為軟骨相關成分的自身免疫可能與疾病發病有關。Tanaka等應用2-DE免疫印跡聯合質譜的方法，用細胞提取蛋白作為抗原來源，檢測到15種自身抗原，并進一步鑒定了其中的5種，這5種自身抗原相對自身抗體出現的頻率依次是微管素α/6為91%、波形蛋白為46%、α-烯醇化酶為36%、鈣網織蛋白為82%、膠原蛋白1/2為36%。數據顯示，自身免疫反應并不受軟骨相關成分的束縛，更準確地說，在RP中有多種自身免疫反應發生，進一步探討了RP發病機制的原因。

蛋白質組學以其深入揭示疾病狀態下機體內所有蛋白質表達規律的優勢，在闡明自身免疫性疾病的特異抗原、抗體和分子機制方面表現出極大的潛力。隨著蛋白質組學研究技術的日趨完善，現行的結構蛋白質組學必然向功能蛋白質組學過渡，為自身免疫性疾病的早期診斷、新藥研發及疾病康復開辟新的思路。

3 結語

蛋白質組學是一門在蛋白質分子水平認識生命機制的新興學科，目前它的許多理論和技術還處于實驗室探索階段，但已顯示出可喜的應用前景。功能蛋白質組研究在醫學領域的廣泛應用具有巨大的潛力，在生物制藥領域中也具有難以估量的應用前景。可能在不遠的將來，人類將能全面了解人類疾病的發生、發展、轉歸機制，在揭示人類生命的奧秘方面獲得重大進展。

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