出入境轉基因產品及其分子檢測現狀與展望

桂國春，李克彬，暢榮妮，舒偉

1.天津出入境檢驗檢疫局，天津 300457；2.湖北省宜昌市微生物研究所，湖北 宜昌 443000；3.廣西醫科大學，廣西南寧530021

隨著生物工程技術的發展，人類能夠在多種生物體內導入外源基因并使其表達，進而通過遺傳學的方法，獲得使外源基因穩定表達并能遺傳給后代的品系，這就是轉基因生物（genetically modified or?ganisms，GMO）。轉基因生物包括轉基因植物、轉基因動物、轉基因微生物等。轉基因產品是指含有或生產過程中有轉基因生物參與的商品，主要包括一些轉基因植物產品和大量以轉基因生物為原料的食品或藥品等。世界第一例轉基因植物轉基因煙草于1983年在美國問世；1986年，首批轉基因植物抗蟲和抗除草劑棉花進入田間試驗；1994年，第一個轉基因植物產品延熟番茄“navrSavr”獲得美國食品與藥物管理局批準進入市場。

自1996年以來，轉基因產品在全球迅速推廣，主要為轉基因植物產品，如轉基因大豆、棉花、玉米、油菜等，其銷售額逐年增長。1995年轉基因植物的全球銷售額為7500萬美元，1996年比前一年增加了2倍，達到2.35億美元，1997年又增加了2倍，達到6.70億美元，2000年全球轉基因植物的產品銷售額高達30億美元，到2010年可望增至200億美元，可見其發展速度是驚人的[1]。我國是最早開展轉基因植物研究的國家之一。到目前為止，我國有近50種轉基因植物在進行田間實驗和環境釋放試驗。我國已經獲得有自主知識產權的轉基因抗蟲棉花。

全球轉基因產品商品化飛速發展，轉基因植物在國際農產品貿易中的比重逐年加大。然而，轉基因植物產品在帶來巨大經濟效益的同時，也伴隨著許多問題。轉基因植物的安全性在全球范圍內引起了激烈的爭論與普遍關注，主要集中在環境安全性和食品安全性兩方面。世界各國正在努力制定相應的法律和法規。我國于2001年5月頒布《農業轉基因生物安全管理條例》。2002年3月20日開始實行的《農業轉基因生物標識管理辦法》規定，國家對農業轉基因生物實行檢驗檢疫和標識制度，凡是在中國境內銷售的大豆、玉米及其制品，若屬轉基因生物，必須進行標識。應轉基因產品生產企業、食品制造商、消費者等多方面需要，將轉基因食品與常規食品區別開，這就迫切需要建立一套有效的轉基因產品檢測方法。隨著標識制度的實行，轉基因產品檢測工作日益增多，各檢驗檢疫單位根據貿易單位要求，相繼開展了對出入境轉基因產品的檢測工作。

1 出入境轉基因產品

出入境轉基因產品泛指國際貿易中一切轉基因生物產品或以轉基因生物為原料的食品或藥品等。轉基因生物產品包括轉基因植物、動物、微生物產品。目前市場上的轉基因動物還不多，幾乎沒有商業化的生產。在國際貿易中的出入境轉基因產品，主要是轉基因植物產品和轉基因食品或藥品。

轉基因植物種類主要有大豆、玉米、棉花、油菜，約占商品化的轉基因植物產品的99%以上，此外還有轉基因馬鈴薯、西葫蘆和木瓜等，其比例小于1%。按照轉入基因的性質，將轉基因植物分為以下幾類：①抗除草劑的轉基因植物（最早進入田間生產，目前栽培面積最大），如孟山都公司的抗除草劑草甘膦大豆；②抗蟲轉基因植物，如先正達公司的Bt176抗蟲玉米；③抗病轉基因植物，如已大量商品化的抗黃瓜花葉病甜椒、抗黃瓜花葉病番茄等；④抗環境脅迫轉基因植物，如一些抗干旱、抗高鹽的轉基因植物；⑤植物發育調節基因工程，如控制果實成熟、雄性不育等改良植物品質的植物，耐儲藏番茄是最早商品化的一個轉基因產品；⑥醫藥領域中的轉基因植物，如一些利用植物作為生物反應器生產的藥用蛋白、食用疫苗等轉基因植物。

轉基因食品或藥品種類繁多，市場上的一些轉基因大豆油、轉基因玉米飼料、轉基因番茄醬等也都是要接受轉基因檢測的對象。歐洲藥品局于2007年6月批準一種源于轉基因動物的藥品在歐盟上市，是此類藥物首次獲準在歐洲上市。該藥名為“ATryn”，由美國馬薩諸塞州的一家生物醫療公司研制。這種藥物是利用轉基因羊的奶研制出的一種抗凝血酶，主要用于體內缺乏抗凝血酶的病人。隨著科技的發展，越來越多的轉基因藥物將會出現，根據標識制度的要求，這些轉基因產品也將接受轉基因檢測。

2 轉基因技術的原理

轉基因技術就是利用基因工程技術把外源基因導入生物體內，然后通過遺傳學的方法獲得穩定的轉基因品系。轉基因技術大致可以分為以下4個步驟：①目的基因的分離：即應用分子生物學的方法分離并克隆具有一定特性的目的基因。例如，通過篩選蘇云金桿菌cDNA文庫，從中獲得對很多昆蟲有毒的Cry9C蛋白基因，用于抗蟲轉基因工程。②目的基因的轉化：即將獲得的目的基因構建到相應的表達載體中，然后借助于不同的媒介，如農桿菌、逆轉錄病毒或基因槍，將含目的基因的表達載體轉入接受生物體內，使目的基因在接受生物體內穩定表達。③轉基因生物個體的鑒定：目的基因是否轉入到生物體內，在體內是否表達，需要通過一定的手段來檢測。通常，隨目的基因轉入的還有一個報告基因，如抗生素基因neo、GUS基因等，通過檢測報告基因是否表達就可以知道目的基因是否轉入植物體內并表達。此外，可以通過Southern印跡、PCR檢測等方法檢測外源基因的轉入情況。④遺傳雜交和選育：對于獲得的穩定表達的轉基因個體，往往還需要和具有優良性狀（如高產、抗病或高品質等）的品種進行雜交和選育，從而獲得既具有目的基因又具有優良性狀的轉基因品系[2]。

3 轉基因產品的分子檢測

基于轉基因技術的原理和轉基因產品的特性，人們設計了一系列檢測方法對轉基因產品進行檢測和鑒定。在國內外已有的檢測技術體系中，按照檢測方法劃分，主要分為兩大類：一類是對外源重組核酸分子進行檢測，另一類是對外源基因表達的目的蛋白進行檢測[3]。

3.1 核酸檢測

構建基因表達載體時常在目的基因的5′端加上啟動子，在3′端加上終止子，以使外源基因能在植物中有效表達，同時不影響其他基因的表達。當啟動子與顯性選擇標記基因（如新霉素磷酸轉移酶Ⅱ基因，neo）連接，構成嵌合基因，這些標記基因同樣能表達，從而提供可篩選的表型。由于啟動子、終止子、標記基因等來源于微生物，是非轉基因植物所沒有的，如常用的根癌農桿菌胭脂堿合成酶啟動子（NOS）來源于細菌，花椰菜花葉病毒（CaMV）、玄參花葉病毒（FMV）35S啟動子來源于植物病毒，標記基因如neo來源于大腸桿菌，因而只要檢測材料中核酸是否存在外源蛋白和外源啟動子、終止子、標記基因序列，即可判斷是否為轉基因產品[4]。

針對轉基因產品的核酸檢測方法主要有3種：一種是定性PCR檢測方法，是轉基因植物的主要檢測方法，具有快速、靈敏等優點；第二種是實時熒光定量PCR檢測方法，突出優點是能夠快速、準確、定量分析樣品中轉基因植物的含量；第三種是South?ern印跡。此外還有基因芯片檢測方法，該方法具有快速、高通量等特點。

3.1.1 定性PCR 最初檢測轉基因產品采用的是定性PCR方法。可以通過對特殊序列（啟動子、終止子、遺傳標記基因）和目的基因（靶基因）進行檢測。在瑞典GMO標識制度中，PCR定性檢測方法起著決定作用。隨著各國出入境檢驗檢疫機構對轉基因生物及其產品檢測結果可靠性要求的提高，簡單的定性檢測方法常伴有假陽性或假陰性結果，已經不能滿足需要。為此，研究者們在定性PCR方法的基礎上，發展了轉基因生物的多重PCR檢測，也稱為復合PCR（multiplex PCR，MPCR）。復合PCR技術在細菌檢測、病毒檢測中得到了較廣泛的應用。MPCR，即是在同一反應管中含有一對以上引物，可以同時針對幾個靶序列或一個靶序列的多個部位同時進行PCR檢測，模板可以為單一的，也可以是幾種不同的樣本。只要有一對引物擴增出陽性結果，就可以判斷為轉基因產品。這樣可以大大提高檢測結果的可靠性。陶震等選用NOS終止子、CaMV 35S啟動子、NOS啟動子的3對引物，利用MPCR技術對5個大豆樣品和6個豆粕樣品進行檢測，同時利用普通PCR方法對上述樣品進行復核驗證，兩者的結果完全符合[5]。Matsuoka等建立了一種MPCR方法來區分轉基因玉米的5個不同品系[6]。珠海出入境檢驗檢疫局利用復合PCR法，以轉基因大豆、玉米、油菜、番木瓜為材料，在同一反應管中可同步檢測35S、NOS及CP4-EPSPS基因，明顯提高了檢測效率。MPCR方法是針對多個靶位點同時進行檢測，其結果較普通PCR更為可信，同時簡化了步驟，節約了試劑。

3.1.2 實時定量PCR（real-time PCR） 目前轉基因成分的準確定量檢測在國際貿易中日趨重要。定量PCR方法可用于確定樣品中GMO成分的百分含量。實時定量PCR方法是普遍使用的一種定量PCR方法。包括2種方法：①非特異性染料結合法。某些熒光素能和雙鏈DNA結合，結合后的產物具有強的熒光效應。當擴增結束后，隨溫度的降低，DNA復性成為雙鏈，熒光素與之結合，激發產生熒光，測定熒光強度，通過內參或外參法求出對比因數，即可以準確定量。②雜交探針標記法。寡聚核苷酸探針帶有一個熒光發光基團和一個熒光淬滅基團，完整的探針在激光激發下，發光基團所產生的熒光被淬滅基團全部吸收，樣品無熒光。但在PCR擴增過程中，Taq酶分子在鏈延長的過程中可以通過自身的5′→3′核酸外切酶活性降解與模板結合的特異性熒光探針，使得熒光發光基團從探針上切下來而與熒光淬滅基團分開，從而在激光激發下產生特定波長的熒光，這種熒光強度隨著PCR擴增過程動態增強。定量PCR儀通過動態監測熒光強度，可以得到每一樣品中特定模板DNA的起始拷貝數[7]。德國推薦的轉基因玉米定量檢測方法就是采用實時定量PCR技術檢測抗蟲玉米（Bt176玉米）。Heide等使用實時定量PCR，完成了8個轉基因玉米食品的定性定量檢測[8]。

3.1.3 Southern印跡 Southern印跡技術是用一段已知DNA片段來檢測未知樣品是否含有這段已知DNA序列，在轉基因產品檢測中這個已知DNA片段為外源基因序列。凡含有外源基因序列的片段都可以發生雜交，形成帶標記的特異性雜交體，最后根據雜交體的放射性質或發光性質進行檢測。Southern印跡具有靈敏性高（可檢出1 pg DNA樣品）、特異性強（可鑒別出20個堿基對左右的同源序列）的特點，是當前鑒定外源基因整合的權威方法，因此在轉基因產品檢測中也常被用到[9]。

3.1.4 基因芯片 基因芯片又稱DNA芯片或DNA微陣列，是指將許多特定的核苷酸片段或基因片段有規律地固定于支持物上形成的DNA分子陣列，然后與待測產品的DNA熒光標記樣品按堿基配對原理進行雜交，再通過激光共聚焦熒光檢測系統等對其表面進行掃描，即可獲取樣品分子的數量和序列信息，并由計算機進行分析、綜合處理。國內外一些公司已生產了轉基因產品檢測基因芯片，用于檢測轉基因生物中常用到的啟動子、終止子、篩選基因、報告基因及常見的目標基因（如抗蟲基因、耐除草劑基因）等[10]。

3.2 蛋白檢測

外源基因在轉基因生物體內一般會表達出蛋白質，針對這些表達的外源蛋白質，人們設計了一系列的檢測方法。

3.2.1 酶聯免疫吸附分析 酶聯免疫吸附分析（en?zyme-linked immunosorbent assay，ELISA）就是將抗原抗體的免疫反應和酶的高效催化反應相結合，根據酶作用于底物后的顯色反應對抗原抗體反應結果進行判斷；當抗原與抗體結合時，偶聯酶會形成有色物質，顏色的深淺與樣品中抗原的含量成正比，據此可定性判斷樣品中目的蛋白的含量。進行定量檢測時，需要做出已知轉基因蛋白成分濃度與吸光度（D）值的標準曲線，然后根據標準曲線由未知樣品的D值來確定樣品中轉基因成分的含量。Lipp等使用ELISA方法，通過抗體特異性地與來源于農桿菌CP4的EPSPS（烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶）結合，檢測抗農達轉基因大豆[11]。現在成功研制的外源蛋白檢測試劑盒，已廣泛應用于定量檢測Bt轉基因水稻、棉花、玉米、大豆。趙紅盈等用此試劑盒檢測了cryl Ac/CpTI雙價抗蟲水稻不同時期、不同部位中Bt殺蟲蛋白的含量。

3.2.2 試紙條 試紙條法是另一種利用抗原抗體結合原理檢測的方法，是將特異抗體交聯到試紙條和有顏色的物質上，當紙上抗體和特異抗原結合后，試紙條上就有顏色反應，如沒有抗原則沒有顏色。美國檢測Starlink玉米中Cry9e蛋白的試紙條已成為美國的官方檢測方法[9]。

3.2.3 Western印跡 從檢測樣品中提取總蛋白，將蛋白質樣品溶解于含去污劑和還原劑的溶液中，經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳使蛋白質按分子大小分離，將分離的各蛋白質條帶原位轉移到固相膜（一般為硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，隨后將膜在牛血清白蛋白溶液中溫浴，以封閉非特異性位點，接著加入目的蛋白的特異性抗體（一抗），印跡上的目的蛋白（抗原）與一抗結合后，再加入能與一抗專一結合的酶標記過的二抗，最后通過二抗上標記化合物的發光或顯色特性進行檢測。根據檢測結果，可得知被檢樣品內目的蛋白表達與否，并粗略估計濃度[9]。

3.3 其他檢測技術

3.3.1 色譜分析 當轉基因產品的化學成分較非轉基因產品有很大變化時，可以用色譜技術對其化學成分進行分析，從而鑒別轉基因產品。再者，有一些特殊的轉基因產品（如轉基因植物油等），無法通過傳統的外源基因或外源蛋白質檢測方法來進行檢測，而借助色譜分析技術可以對樣品中脂肪酸或甘油三酸酯等各組分進行分析，以達到轉基因檢測的目的[12]。

3.3.2 生物傳感器技術 生物傳感器是將探針或配體固定于傳感器芯片的金膜表面，含分析物的液體流過傳感器芯片表面，分子間發生特異性結合時可引起傳感器芯片表面折射率的改變，通過檢測表面等離子體共振（SPR）信號的改變而監測分子間的相互作用[12]。

3.3.3 近紅外線光譜分析法 轉基因過程有時會使植物的纖維結構發生改變，通過對樣品的紅外光譜分析，可對轉基因植物進行篩選[12]。

4 轉基因產品發展趨勢及其檢測方法展望

4.1 轉基因產品發展趨勢

隨著生命科學研究的發展，人們對基因的認識越來越多，對其功能的了解越來越深入。人類不斷認識到更多的具有特殊功能的基因，這些基因可以作為轉基因生物工程的材料，用于制造轉基因抗蟲抗病植物、改良的轉基因品質植物或轉基因藥物動物等。隨著轉基因生物工程的不斷發展，將會有越來越多的轉基因產品進入人們的生活中，尤其是利用一些品質改良的植物或轉基因動物制造的產品在食品和藥品中占的比重將越來越大。

在全球化背景下的國際貿易中，技術發達國家研究的優良品質的轉基因產品在國際貿易中將逐步增多。可以展望，在未來的10年中，轉基因食品和轉基因藥品將被發達國家一些先進的技術公司廣泛引入人們的生活中。如加拿大完成了表達水蛭素的轉基因油菜的商業開發，利用轉基因油菜種子生產的水蛭素已作為藥物使用。這是完成商業開發的第一個轉基因藥物[13]。美國Sigma-Aldrich公司生產的重組抗生物素蛋白，也是從轉基因玉米中表達、生產并提取的。迄今，已成功地在煙草及向日葵中表達了人生長因子，在煙草和馬鈴薯中表達了人血清白蛋白，在煙草中表達了人促紅細胞生成素、膠原，在水稻中表達了α干擾素，在玉米中表達了抑肽酶等。此外，一些常用藥物，如胰島素、腦啡肽、人凝血因子、白細胞介素和胸腺素等也在轉基因植物中獲得表達。可以期待，在不遠的將來，一系列轉基因藥物將會逐步得到商業開發，走進人們的生活，并進入國際貿易[14]。

4.2 轉基因產品檢測標準化與委托鑒定

隨著轉基因產品的不斷問世，新型的外源基因將不斷增加，轉基因產品的檢測方法也會不斷得到改進。許多國際組織對轉基因生物檢測問題高度重視，在組織內部設立專門機構負責轉基因生物檢測技術標準化工作，如聯合國糧農組織（FAO）、世界衛生組織（WHO）、世界經濟發展合作組（OECD）、世界貿易組織（WTO）、國際食品法典委員會（CAC）、國際標準化委員會（ISO）和歐洲標準化委員會（CEN）等。世界各國也相繼成立專門機構或在相關機構中設立專門部門，負責轉基因生物安全檢測技術標準化工作。1997年以來，歐盟從抽樣、核酸提取、蛋白檢測、核酸檢測等方面開展了系統研究，形成了成熟的檢測方法和技術體系，建立了完善的方法驗證程序和平臺，對已建立的檢測方法和技術體系開展了系統驗證。在轉基因產品檢測技術標準化方面，歐盟走在世界前列，已建立了比較完善的技術體系，包括檢測信息收集、技術研究、方法驗證、標準制定、實驗室水平測試與認證等；同時，針對獲得純合的陽性或陰性轉基因植物材料比較困難的實際問題，開展轉基因產品檢測標準物質研制工作，建立了比較完善的轉基因產品檢測標準物質研制程序，目前已制備出近20種轉基因產品的標準樣品[15]。

標準化的檢測程序還不能最終確保世界各地的實驗室對同一批轉基因產品的檢測得到一致的結果，因為不同實驗室對檢測的實施由于環境條件和操作熟練程度不一樣可能導致檢測結果會有差別。委托一些公共認可的、權威的試驗室專門從事某種類型的轉基因產品的鑒定，能夠有效解決這個問題，并且標準化的檢測程序在同樣的檢測條件下實施，其檢測結果將更具有可比性。委托鑒定不僅可以使檢測結果更加可靠更具有可比性，而且由于規模化和專業化，可以大大降低檢測成本[16]。

基因工程的發展使轉基因產品越來越多地進入人們的日常生活。轉基因產品的安全性問題正受到社會各界的關注，而各國政府建立的轉基因標識制度能否順利實行的關鍵就在于能否建立準確可靠的轉基因檢測技術。總之，標準化、高靈敏度、高通量、自動化、低成本是轉基因檢測技術的發展趨勢。

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