p53基因及其功能研究進展

李文娟，潘慶杰，李美玉

青島農業大學 動物生殖發育與基因工程研究所，山東 青島 266109

抑癌基因包括Rb基因、p53基因、NF-1基因、WT基因、結腸腺瘤性息肉（APC）基因和結腸癌缺失（DCC）基因等[1]，其中前兩者為最重要且最為人了解的2個基因。自發現p53基因以來，人們對該基因的認識逐漸深入。p53基因家族包括p53、p63、p73基因。有研究顯示，在p53激活Bax、PARP通路和細胞凋亡的過程中，TAp63和TAp73起重要作用，也就是說p53、p63和p73之間存在相互作用。其中，p53基因在細胞應激和腫瘤抑制中起關鍵作用，該基因有DNA修復、阻滯細胞周期、抑制血管生成、導致細胞凋亡等作用。調查發現，在人體發生的所有惡性腫瘤中，有一半以上會出現p53基因的突變或缺失，說明該基因在人類腫瘤的發生上有重要作用。因此，自1979年Lane[2]等發現該基因以來，各國科學家對該基因及其功能進行了大量研究。在此，我們簡要闡述國內外對p53基因及其編碼產物的研究現狀。

1 p53基因的結構和作用機制

1.1 p53基因的結構

人類p53基因位于17號染色體短臂1區31帶，即17p13.1，由11個外顯子和10個內顯子組成，其cDNA全長2074 bp，有單一開放讀框，其中第1個外顯子不編碼，其上游400 bp處有啟動子p1，下游1 kb處有啟動子p2，兩者為轉錄起始點，第2、4、5、7、8外顯子分別編碼5個進化上高度保守的結構域[3]。其下游基因主要包括 p21、MDM2、CD95/fas、Bax、WT1、p53AIPI、pig3、Cyclin G等[4]，并直接影響了p53基因的多樣性。p53分為野生型和突變型，野生型p53為正常的p53基因，其突變方式包括點突變、缺失突變、移碼突變、基因重排等。野生型P53蛋白的半衰期很短，用免疫組化很難檢測到；而突變型P53蛋白的空間構象發生改變，半衰期延長，用免疫組化可以檢測出，因此當檢測到組織中P53蛋白表達量高時，可以判斷為突變型P53基因。P53蛋白主要包含3個功能區域，即N2末端轉錄區域（TAD）、C2末端寡居區域（OD）和核心區域（DBD）[5]。由于DBD可以結合特異序列的DNA，因此最為重要。

研究發現p53基因的3個多態性位點與雌激素代謝相關的腫瘤疾病有關聯[6]：p53基因第4外顯子72位密碼子具有GGT/CCT單核苷酸多態性，使編碼的精氨酸被脯氨酸取代，與多種腫瘤的易感性有關；第3個內含子區16 bp的插入序列5'-GACCTGGAG?GCTGGG-3'多態性，有該序列的等位基因是A'，無該序列的為A，前者較罕見；第6內含子的MspⅠ限制性酶切位點G/A單核苷酸多態性，其中第一種與腫瘤相關性的研究最多。第4外顯子編碼的精氨酸和脯氨酸均為野生型，穩定性相同，空間構象和P53抗體的結合表位相似，但分子生物學行為和功能不完全相同。P53脯氨酸型蛋白與部分轉錄因子的結合較強，可能更有效地激活轉錄，使下游基因表達上調，而P53精氨酸型蛋白則能較好地抑制轉化細胞的生長、誘導細胞凋亡，以及對細胞損傷進行修復[7]。

1.2 P53蛋白的作用機制

p53基因轉錄生成全長2.5 kb的mRNA，后者編碼的蛋白含393個氨基酸殘基，相對分子質量為53×103。p53基因可調節大量靶基因的表達，進而影響細胞周期組織、凋亡、分化、靜息、DNA損傷、血管生成和轉移的抑制及其他功能[8]。

野生型P53蛋白有抗細胞增殖的作用，抑制細胞生長和分裂，使其停留在G1期而不進入S期。其作用機制為：由于野生型P53蛋白可通過抑制細胞的生長，為細胞內DNA修復酶修復損傷DNA爭取更多的時間，避免DNA突變在染色體上的積累，如果損傷的DNA太嚴重而無法修復時，P53會觸發凋亡系統調控受損細胞凋亡。野生型P53蛋白具有上調CDK抑制劑p21WAFI/CIPI基因轉錄的生物學效應，進而降低CDK的活性，不能磷酸化Rb進而使細胞停留在G1/S期。該蛋白還可以與增殖細胞核抗原（PCNA）共同作用，降低DNA聚合酶的活性，使損傷細胞的DNA復制過程停止，進而開始DNA的修復[9]。

P53聯系著不同的細胞應急和細胞應答，受離子輻射、化學藥物及異常的細胞信號的刺激而得以表達，表達升高后受到p53-mdm2、p14ARF-mdm2環路的精確調節。已開發出一種能干擾p53-MDM2復合物形成、促進P53蛋白釋放并誘導細胞周期停滯或促進細胞凋亡的類似P53蛋白的多肽[10]。而Svane等[11]已研制出結合了P53肽段的樹突細胞疫苗，臨床發現P53表達增高，有三分之一的患者病情穩定或輕度消退。

2 p53基因表達的檢測

通過對p53基因及其產物的監測，可以對腫瘤做出早期診斷和預測，并且可以對腫瘤的發生、發展和預后做出科學推斷。

2.1 納米探針檢測

由于納米金顆粒具有表面效應、小尺寸效應及較好的生物相容性，因此日益受到人們的關注[12]。1971年Faulk和Taylor[13]用免疫金與兔抗沙門菌抗血清結合檢測表面抗原，納米金作為一種免疫標記技術開始快速發展。蘇州大學黃云艷的畢業論文中提到使用標記了P53捕捉抗體的納米磁珠來富集和分離血清中的P53蛋白，然后用標記了P53檢測抗體和HRP的納米金探針檢測已富集的P53蛋白。用IgG-Au-DNA-HRP型探針檢測P53蛋白，當HRP分子和P53抗體的比例為2.5∶1時效果明顯。

2.2 免疫組織化學檢測

免疫組織化學法的原理就是利用特異性抗體與P53蛋白發生抗原抗體顯色反應，根據顯色斑點的有無和強弱，間接判斷P53蛋白的有無或多少。該方法得到了廣泛應用[14-15]，但不能大批量篩查樣本。

2.3 利用同位素免疫檢測

可以利用同位素標記進行抗原抗體反應來檢測蛋白質。放射性同位素標記物的顯示具有高靈敏性，抗原抗體反應具有高特異性，兩者結合起來檢測P53蛋白，精確性高，樣品用量少，且易規范化和自動化[16]。

2.4 流式細胞儀檢測

有研究證明，用流式細胞儀可以雙參數分析P53蛋白和DNA的關系[17]，該實驗用DO-1單抗標記P53蛋白，用PI染色DNA，結果證明可以用該方法測定P53蛋白。

2.5 組織微陣列檢測

組織微陣列又稱組織芯片，是將若干石蠟包埋塊上的各種典型組織轉移到一個新石蠟塊上重新構建微型化高通量組織陣列的方法。用該方法可在一張玻璃板上排列成百上千個組織標本，進而研究組織標本DNA、RNA或蛋白質的表達。可以用該法測定P53蛋白，具有數據量大、微型化、自動化和節省勞動力等優點。

2.6 酶聯免疫吸附試驗

酶聯免疫吸附試驗（ELISA）的基本過程是將抗原（抗體）吸附于固相載體，在載體上進行免疫酶反應，底物顯色后用肉眼或分光光度計判定結果。檢測P53蛋白可采用雙抗夾心法，原理仍然是抗原抗體特異反應，洗脫未結合部分，顯色顯示P53蛋白含量。實驗證明該方法敏感性強，特異性、重復性和穩定性好[18]。但該方法有容易出現假陽性和操作繁瑣等缺點。

3 p53基因的功能及應用研究

3.1 p53基因的功能

p53基因的具有阻滯細胞周期的作用。p53基因可以調節細胞周期中G1和G2/M期校正點的監測，與轉錄激活功能密切相關，p2IWAF/CIPI基因是p53的下游基因，該基因編碼的蛋白可以與一系列Cyclin-CDK復合物結合，導致高磷酸化Rb蛋白堆積，進而抑制E2F轉錄因子活性，使G1期阻滯。

p53基因還具有促進細胞凋亡的作用。p53基因可以通過Bax/Bcl-2、Fas/Apo1、IGF-Bp3等蛋白調控細胞凋亡，還可以通過死亡信號受體蛋白如TNF受體和Fas蛋白途徑誘導凋亡。有學者認為p53還可以直接刺激線粒體釋放高毒性的氧自由基引發凋亡[19]。

p53基因可以維持基因組穩定。P53參與DNA的修復過程，切除錯配核苷酸結合和調節核苷酸內切修復因子的活性，如XPB因子和XPD因子。還可以利用自身3'→5'核酸外切酶活性與p21WAFI、GADD45和PCNA形成復合物發揮作用。

p53基因可抑制腫瘤血管生成。當腫瘤生長到一定程度以后，能通過自分泌途徑形成促血管生成因子，刺激營養血管在腫瘤實質內增生。研究發現p53基因可調控下游多個基因的表達，刺激抑制血管生成基因的表達，進而起到抑制腫瘤血管生成的作用，因此在各種腫瘤疾病的研究中發揮重要作用。

3.2 p53基因在膽管癌中的研究

對膽管癌的研究發現，p53基因的突變均發生在高度保守區，主要分布在CPG位點，由G∶C向A∶T轉化。Head等[20]進一步證實膽管癌細胞中的p53基因第272～282密碼子存在錯義、插入及缺失突變。

3.3 p53基因在肝癌中的研究

研究證明，p53基因的突變與肝癌的病理密切相關，突變率與肝癌分化呈負相關。此外，p53基因的表達還與腫瘤生長與浸潤有關，有實驗證明浸潤性肝癌P53蛋白的表達顯著高于非浸潤性。有研究發現p53基因249位點的突變與肝癌轉移發生率、腫瘤包膜完整性、有無肝內播散結點、是否為多發病灶等密切相關。

3.4 p53基因在胃癌中的研究

胃癌中最常突變的抑癌基因就是p53，不同類型及不同病因所致的胃癌患者，該基因的突變率不同。p53基因的突變和過表達發生在癌變的不同階段，在晚期胃癌和轉移者中更常發生，而不完全結腸化生和異型增生也有較高的檢出率。在腸型胃癌中，p53基因突變以無義突變、內含子突變、沉默突變常見，且突變率高于彌散性胃癌。此外，有萎縮性胃炎病史的患者，該基因的突變率也明顯較高。

4 p53基因的研究前景

自p53基因被發現以來，對該基因細胞調控方面的研究取得了一些進展。有研究發現ONXY-015系統可以定位并殺死高表達p53變異基因的靶細胞，而且不損傷表達野生型的細胞。也有研究發現糖-膽固醇的去泛素化作用不僅可以通過增加p53的穩定性而引發細胞增殖抑制和細胞凋亡，還可以激活p53家族通路。糖-膽固醇的去泛素化作用還可以激活Pinl，全面活化p53，誘導細胞凋亡[21]。

對p53基因的研究開始應用于癌癥的臨床治療上。用野生型p53基因轉染腫瘤細胞，可能有效抑制腫瘤的生長，并且脂質體轉染p53動物模型已構建成功，已開展通過重組腺病毒介導的p53基因來治療惡性腫瘤。研究發現，p53可以通過誘導細胞周期捕獲、細胞凋亡和DNA修復而提高腫瘤細胞對放療、化療和熱療的敏感性，所以，如果利用該基因和傳統的化療等手段聯合使用，會取得較好的治療效果。腫瘤基因治療方法的不斷深入研究發現調節腫瘤細胞最有效的途徑就是轉染那些失活的腫瘤抑制基因，而p53能通過誘導細胞周期捕獲、細胞凋亡和DNA修復，從而提高腫瘤細胞對放療、熱療和化學藥物的敏感性，這些優點使p53基因的功能在腫瘤的治療和預防方面得到越來越多的關注。

隨著對p53基因的研究，更多治療腫瘤的新思路被提出：下調突變型p53基因的活性與表達；引入特殊的細胞因子，抑制腫瘤的惡性表型，進而使癌細胞轉為正常的細胞；采用點突變，修復突變基因或使突變基因失活。

隨著p53基因網絡的提出，人們將對P53在各種癌癥中的作用機制進行更深入的研究，不是孤立地觀察各個基因，而是結合起來分析。相信該基因的作用將會得到更好的闡述，同時會充分利用P53功能及突變尋找更有效的載體，提高轉染率，開發更多的可有效治療各種癌癥的藥物。

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