冷誘導RNA結合蛋白研究進展

李俊峰，劉雨瀟，張志文，洪鵬，薛菁暉

1.解放軍總醫院 第一附屬醫院神經外科，北京 100048；2.遼寧醫學院解放軍總醫院第一附屬醫院 研究生培養基地，北京 100048

冷誘導RNA結合蛋白（cold inducible RNA binding protein，CIRP）是一種RNA結合蛋白，又稱hnRNP A18。人CIRP的cDNA序列1997年由Fujita實驗室率先克隆報道，GenBank/EMBL/DDBJ序列號為D78135[1]；同年，大鼠CIRP的cDNA由Xue等登錄于 GenBank/EMBL/DDBJ，序 列 號 為 AB00362[2]。CIRP的相對分子質量為18 000，由172個氨基酸殘基組成，包括2個明確的區域。第一個為RNA結合域（RMM基序），其中包括一個八聚體核糖核蛋白1（RNP1）和一個六聚體核糖核蛋白2（RNP2），此區域在不同的種系中高度保守，并且參與結合RNA；第二個為富甘氨酸結構（RGG基序），但它的功能還不清楚。

人類的CIRP基因定位在第19號染色體p13.3位點上[3]。第19號染色體是人類所有染色體中基因密度最高的，約有1500個基因，于2004年在Nature雜志上公布了全序列[4]。它具有高G+C含量、高復制率和高重排率的特點，預示著該染色體在生物進化中有重要意義。其中許多基因與呈孟德爾式遺傳規律的疾病有關，包括家族性高膽固醇血癥、非胰島素依賴性糖尿病等。人體遭到輻射或其他環境污染，控制DNA修復的基因也在這條染色體上。在K562、HepG2、NC65等多種人類細胞系及大鼠的腦、肺、腎臟、肝臟、胃、結腸、卵巢、睪丸、甲狀腺和骨髓組織中[2]，CIRP均有結構性的表達，并在應激原的刺激下表達升高或降低。

CIRP蛋白的細胞定位具有組織特異性。在人和動物的大多數細胞中，CIRP位于細胞核[1]，然而在人精子細胞質[5]和非洲爪蟾卵母細胞質[6]中也可檢測到CIRP。有研究者發現CIRP可在應激原的刺激下，由精氨酸甲基化作用支配，從細胞核遷移至細胞質中，并據此推測CIRP在細胞中的位置取決于細胞的類型和狀態[6]。

作為一種重要的生理活性物質，CIRP主要通過轉錄后水平的基因表達調控來發揮作用。轉錄后水平調控是細胞生長和分化過程中最重要的調節機制之一，會影響多種基因的蛋白表達水平和細胞內蛋白表達的特定位置，從而影響細胞的分化方向。RNA結合蛋白是轉錄后水平基因表達調控的主要承擔者，調節mRNA的剪輯、出核、運輸和細胞定位等[7]，并由此改變細胞的生理功能。目前對CIRP的研究主要在低溫（32℃）下，其調控的關鍵點在于mRNA的翻譯，通過CS-RBD來特異地與靶RNA的特異結構或序列結合來調控特定基因表達，從而對環境信號做出快速反應。另外，CIRP結合到mRNA的5′或3′非翻譯區（UTR）可以影響翻譯起始的速度和轉錄子的穩定性。但有一些問題還待進一步研究：一個RNA結合蛋白有多少個目標mRNA；RNA結合蛋白與mRNA的5′或3′UTR結合是否依賴其他蛋白，以及這些蛋白是如何影響其功能的；上述相互作用是如何增強或阻礙翻譯的。

1 CIRP與應激反應

應激是指機體在受到應激原剌激時所出現的以交感神經興奮和垂體-腎上腺皮質分泌增多為主的一系列神經內分泌反應，以及由此而引起的各種機能和代謝的改變。應激是一種全身性的適應性反應，在生理學和病理學中都有非常重要的意義，適當的應激對機體可以產生保護作用，過度應激則會造成傷害。應激是一個復雜的反應過程，通過研究它的發生原理、進程及其調控，使生物體能夠在有效進行生理性應激的同時，最大限度地降低病理性應激及其帶來的損害，無疑對人們日常生活及臨床患者治療都具有指導意義。此前多項研究表明，CIRP的表達水平受到眾多環境因素的影響，在低溫[8]、紫外線[9]、高滲[10]、缺氧[11]等應激狀態下，CIRP 發揮著重要的細胞保護作用。

首先，CIRP的表達與低溫高度相關，37℃條件下CIRP基因的轉錄產物不包含CIRP全長開放讀框，溫和冷處理可顯著提高CIRP的表達水平，相反熱處理會降低其表達水平。有研究者將K562、HepG2、NC65等細胞系由37℃轉移至29℃，發現CIRP基因的表達水平在前12 h內顯著升高，并據此推測CIRP在冷應激反應中發揮著重要作用。2006年，Sakurai等[8]發現低溫條件下CIRP能夠抑制腫瘤壞死因子TNF-γ和環已酞亞胺介導的細胞凋亡。2007年Kim等[12]研究表明，來源于擬南芥的CIRP蛋白能顯著提高大腸桿菌對低溫的適應能力。2011年本研究小組發現，低溫條件下CIRP可抑制H2O2誘導的神經元細胞凋亡[13]。

除了低溫外，缺氧也是影響CIRP表達水平的重要因素。氧濃度對于血管神經發育、糖代謝等生理活動有著重要的調節作用，當氧濃度降低時低氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）被活化，HIF-1可以通過上調血管內皮生長因子（vascu?lar endothelial growth factor，VEGF）和葡萄糖載體1（glucose transporter，Glut1）等蛋白的轉錄水平來促進血管生成，緩解低氧對生物體造成的損傷。最新的研究發現：①低氧信號轉導通路與低溫信號通路具有相同的組成元素。受低氧調控的mRNA與受低溫調控的mRNA都包含內部核糖體進入位點（IRES），當環境發生改變時，大部分mRNA的翻譯水平會受到影響，然而含有IRES元件的mRNA仍可有效翻譯。②CIRP的mRNA序列中存在HIF-1α共有序列結合位點，低氧環境可通過HIF-1不依賴的機制誘導CIRP的表達[14]。

此外，大量的體外實驗證明CIRP在紫外線照射及高滲透壓條件下，發揮著細胞保護作用。當細胞受到紫外線照射損傷后，CIRP會由細胞核轉位到細胞質中，并通過綁定特定的轉錄因子來活化應激誘導蛋白，使細胞迅速對環境信號做出應答[15]。具體過程如下：第一步，CIRP蛋白在應激信號的誘導下發生轉位，聚集于細胞質的應激顆粒中，并發生甲基化。C端的甲基化水平決定了CIRP在細胞中的定位情況，而CIRP的定位情況似乎最終決定了應激狀態下某種mRNA轉錄產物是發生降解還是發生易位。第二步，應激顆粒中的CIRP蛋白募集特異的mRNA，使它們移入應激顆粒。在紫外線照射下，靶向mRNA的3′UTR會直接與CIRP發生相互作用。最后一步，CIRP蛋白綁定復制蛋白A及硫氧還蛋白的3′UTR，通過與翻譯元件的相互作用來從翻譯水平調節特定mRNA的表達量。硫氧還蛋白是一種廣泛存在的多功能蛋白，可通過抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）來調節細胞的細胞信號轉導，可將H2O2還原為H2O，還可活化HIF-1與VEGF。

紫外線照射、低氧等應激因素除了通過甲基化修飾來調節CIRP的表達，還可通過活化GSK3β激酶使CIRP發生磷酸化，轉位到細胞質中綁定硫氧還蛋白基因的轉錄產物。因此，深入研究體內促使CIRP發生磷酸化的激酶，從而闡明在不同應激條件下CIRP發揮作用的機制是下一步研究的熱點。

2 CIRP與腫瘤發生

腫瘤發生的過程可以分為細胞永生化、細胞轉化、細胞侵潤、細胞轉移幾個階段。細胞過度生長是腫瘤發生的重要因素，然而有機體具有精密的機制用以防止細胞不受控制的生長和惡變，細胞衰老就是其中之一。因此，當細胞因為基因突變而避免衰老時，腫瘤就會發生。1997年，Nishiyama等[1]發現CIRP在低溫環境中可調節哺乳動物細胞的周期；2006年，Sakurai等[3]發現低溫條件下CIRP具有抗凋亡作用；2009年，Artero等[16]發現低溫等外界刺激引發的CIRP升高會增加P-ERK1/2的表達水平，并影響翻譯起始蛋白4EB-P1與S6的磷酸化水平，從而使小鼠胚胎細胞發生永生化。上述研究提示，在溫和低溫條件下，內源性CIRP的活化可以極大限度地抑制細胞凋亡。此后的大量研究表明，生理條件下CIRP與腫瘤的發生具有密切聯系。有研究分析了193例相同年齡段腫瘤患者的CIRP表達水平，發現CIRP表達升高與腫瘤發生具有相關性，33%結腸癌患者與45%乳腺癌患者的CIRP表達水平明顯高于對照組。2009年Zeng等[17]發現抑制CIRP蛋白的活性會降低前列腺癌細胞（LNCaP，PC-3）的增殖能力，敲除CIRP基因不僅能降低癌細胞存活率，還能提高癌細胞對化療藥物的敏感性。此外有研究證實，HeLa、TERA2等細胞的生長也會因CIRP表達的降低而受到抑制。這提示CIRP也可被作為治療癌癥的靶點。

目前，對CIRP促進腫瘤發生的機制的看法是：翻譯水平的突變在細胞轉化及腫瘤發生中起重要作用，在常溫條件下，CIRP可通過與翻譯元件的相互作用來促進mRNA的翻譯，加快特定蛋白的合成、刺激細胞增殖。其詳細作用機制尚不明確。

3 CIRP在神經系統中的作用

1998年，Nishiyama等[18]發現CIRP位于小鼠神經元細胞核中，氨基酸序列類似于植物晝夜節律蛋白，可在小鼠神經系統的不同區域晝夜節律性表達，白天表達水平升高，夜間表達水平下降，并據此認為CIRP對神經發育具有重要的調節作用。2008年Stephanie等發現XCIRP在非洲蟾蜍的前腦發育中發揮著不可或缺的作用，敲除XCIRP會使蟾蜍前腦神經板異常增大。2010年，Saitoa等[19]將小鼠神經干細胞培養于含或不含表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）的培養基中，發現去除EGF會增加神經干細胞凋亡率、降低巢蛋白（nestin）陽性細胞數量，并促進神經干細胞分化為神經膠質細胞。然而適當的低溫條件可通過活化CIRP來抑制去除EGF所引發的干細胞凋亡與分化，維持神經干細胞的干性。該研究提示CIRP在低溫神經保護中發揮著重要作用，有望用于神經干細胞的冷凍保存。

本研究小組1997年從大鼠睪丸中克隆出CIRP基因，多年來一直致力于對CIRP基因的研究[2,20-21]。近年，我們主要探討了CIRP在神經保護方面的作用，發現在常溫環境下，CIRP在腦皮層和海馬中低水平表達，在下丘區僅有微量表達；在低溫環境下，腦組織中CIRP表達水平明顯升高，且具有區域性和時間性差異，下丘腦區的CIRP表達增強的出現明顯早于其他腦區。此外，缺血性損傷可以推遲低溫造成的CIRP的表達，但并不能降低CIRP的表達量。在此基礎上，我們進一步分析了CIRP在低溫條件下對神經元細胞凋亡的調節作用，發現低溫環境能通過活化CIRP來抑制H2O2誘導的神經元細胞凋亡。上述研究結果提示，CIRP在低溫神經保護中可能發揮重要作用。

4 CIRP調節生物節律相關基因的表達

2012年，有關CIRP的生物學功能研究有了突破性進展。日內瓦大學的Schibler教授揭示了體溫節律性變動影響“晝夜節律基因”表達的分子機制[22]。他們發現溫度的變化可調節CIRP蛋白的節律性表達，是體內晝夜節律基因激活的必要條件。我們身體中的大部分細胞內有一個“晝夜節律調解系統”,由一組基因組成，周期性變化。研究人員還發現，與大部分調控蛋白不同，CIRP是通過結合到某些基因轉錄物的RNA上來控制這些基因的表達并發揮調節作用的。機體的許多生理功能如心率、激素分泌、體溫等都與細胞內部晝夜節律基因表達的時相及強弱相關，CIRP與這些調控的關系正一一解明。同一團隊利用開發的尖端遺傳工程技術鑒別了活細胞中幾乎所有與CIRP結合的靶RNA，得出“在細胞中CIRP結合了編碼不同晝夜節律調節器蛋白的轉錄物，提高了它們的穩定性，使得它們累積”的結論，說明這種調節順序是，溫度變化誘導CIRP表達發生變化，再激活下游晝夜節律調節器基因，引發機體發生生物學功能改變。這一發現，使我們觀察到的每1℃體溫差異都呈現出新的意義。受到CIRP調控的這些生化體系中，還發現了一個參與藥物解毒和代謝的蛋白DBP（albumin D-site-binding protein），它的周期性累積可對藥物代謝起調節作用。有些抗癌藥物在早上給予患病的小鼠可導致100%的死亡率，而在晚上接受同樣劑量的小鼠卻全部存活了下來。這表明體內生物鐘對藥物的效用和毒性有著極其重要的影響。

5 CIRP的其他作用

CIRP除了調控與晝夜節律相關基因的表達強度外，可能也參與其他細胞過程，如細胞周期進程及細胞黏著相關功能。實驗證實，肝細胞再生依賴這一調節過程[23]。還有研究表明，CIRP在胚胎發育、動物冬眠等活動中也起重要作用。Saito等[24]發現牛蛙腦中CIRP的表達量受到季節的影響，夏季表達降低，冬季則顯著升高，并據此推測CIRP表達變化與動物冬眠相關，可能在冬眠過程中發揮一定的作用。2008年Kenkichi等[25]以日本樹蛙為模型再次證實CIRP的表達量與動物冬眠之間存在著一定的關系。盡管觀察到了上述現象，CIRP在動物冬眠中所發揮的具體作用還有待進一步研究。在原腸（胚）形成過程中CIRP高表達，有研究者降低了非洲爪蟾胚胎中CIRP的表達量，發現超過半數的胚胎在22細胞期時死亡，此外該研究者還發現在胚胎發育至32細胞期時降低CIRP的表達量會導致胎腎發育異常。

6 結語

綜上所述，CIRP作為一種冷應激狀態下大量表達的RNA結合蛋白，廣泛參與細胞的各種生理過程，并在其中發揮重要作用。有關CIRP的研究將有助于揭示應激反應的分子機制，其在神經元缺氧狀態下抗凋亡作用的發現，也為神經保護藥物開發提供了新的實驗依據。鑒于其表達改變會對細胞生長周期帶來影響的特點，我們也思考其抑制腫瘤細胞生長的可能性。有關CIRP的研究已取得了可喜進展，今后還有很多領域吸引我們的關注，如與CIRP發生結合的眾多mRNA，其編碼的蛋白質在體內具有何種功能，是如何被調節的；CIRP與靶mRNA的結合是否依賴上游蛋白的調節；CIRP在神經元保護功能中的作用機制等。溫和的低溫條件是誘導哺乳動物細胞產生重組蛋白的有效工具。在32～33℃條件下，CHO細胞產生重組蛋白的效率遠高于37℃。已知低溫保護可用于包括心臟外科、神經外科、器官移植中的器官轉運等多個領域，低溫對心臟停搏或中樞神經系統缺血的治療及預后具有重要意義。還有文獻報道，哺乳動物對溫和低溫產生的應激反應與長時間航天旅行相似。我們認為，由溫度改變引發的CIRP表達量的改變，進而造成下游一系列的生物學改變，其對生命過程的意義值得深入研究。

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