MS2噬菌體衣殼蛋白與包裝位點結合特異性及其生物學應用進展

孫士鵬，劉貴建

中國中醫科學院 廣安門醫院檢驗科，北京 100053

噬菌體是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱，因部分能引起宿主菌的裂解，故稱為噬菌體。MS2噬菌體為正義單鏈RNA噬菌體，屬于輕小噬菌體科、輕小噬菌體目、輕小噬菌體屬,由外裹蛋白衣殼的核酸組成，是性菌毛RNA大腸桿菌噬菌體的4個血清型中第1血清群的典型代表。MS2噬菌體基因組含有3569個核苷酸，同時作為mRNA編碼4種蛋白質分子，即成熟酶蛋白（也稱A蛋白）、衣殼蛋白、復制酶蛋白和裂解蛋白[1-2]。MS2噬菌體能夠通過吸附性菌毛（F-pili）感染雄性大腸桿菌，感染后每個細胞能產生103～104個噬菌體[2]。電子顯微鏡下MS2噬菌體直徑約27 nm[3]，衣殼蛋白是噬菌體外殼的主要蛋白，由180個化學結構一致的亞基組成，每個亞基含有129個氨基酸殘基，形成二十面體對稱結構[4]。A蛋白的功能是使噬菌體識別宿主并使其RNA基因組進入宿主菌，每個噬菌體一般只存在1分子的A蛋白。噬菌體對宿主寄生具有高度特異性，只能侵染一種細菌中的某一菌株。MS2噬菌體的宿主是大腸桿菌，在人和動物的排泄物或污染的井水、河水中廣泛存在，因其物理結構、組成和形態學、環境生存力與人腸道病毒極其相似，且易于培養，可作為人腸道病毒的替代病毒，用于水和污水的研究等[5-8]。

1 MS2噬菌體衣殼蛋白與包裝位點結合特異性的生物學應用

MS2噬菌體復制酶編碼基因5'端存在一個由19個堿基組成的莖環結構（包裝位點，ACAUGAGGA UUACCCAUGU），是衣殼蛋白二聚體與RNA相互作用的部位，這種相互作用形成的復合物是噬菌體自我包裝的信號，在復合物的基礎上，成熟酶蛋白與其他包膜蛋白分子結合，并在自由能的驅動下形成相應的空間構像，完成MS2噬菌體的組裝[2]。包裝位點同時還是一個翻譯調節元件，當衣殼蛋白表達量超過組裝需求量后，衣殼蛋白二聚體與包裝位點的結合能阻止核糖體結合到復制酶的起始位點上，從而抑制復制酶的翻譯，完成其對翻譯的調節[9-10]。

1.1 用于RNA病毒核酸檢測的標準物質、校準品和質控品

利用衣殼蛋白二聚體與包裝位點結合的特異性，通過基因克隆技術，把包裝位點編碼RNA融合至外源RNA序列上，即可將外源RNA包裝到衣殼蛋白內組裝成MS2噬菌體樣顆粒（或稱病毒樣顆粒，VLP）。Peabody[11]等構建了一個雙質粒表達系統，其中一個表達質粒用來表達MS2衣殼蛋白，另一個表達質粒中克隆了MS2 RNA包裝位點的cDNA序列和lacZ基因，lacZ基因在包裝位點的cDNA序列的下游。由于這2個表達質粒含不同的復制起點和抗生素抗性基因，因此可共存于同一個宿主菌中。然后，把這2個重組表達質粒同時轉化大腸桿菌，經過夜培養和誘導表達后，形成了大量包裝外源RNA的MS2 VLP。在此基礎上，其他研究人員發展了帶盔甲的RNA（armored RNA）技術，顧名思義，MS2衣殼蛋白像盔甲一樣能夠有效保護RNA不被RNA酶降解，具有耐RNA酶、類似病毒顆粒和無生物傳染危險性的特性，被廣泛用于RNA病毒核酸檢測的標準物質、校準品和質控品[12-15]。Rowsell等將MS2野生型19堿基莖環結構的-5位尿嘧啶替換為胞嘧啶（命名為C-variant），使C-variant適配體與衣殼蛋白的親和力與野生型相比提高了10～50倍[16]。衛生部臨床檢驗中心的李金明研究員等通過對C-variant的數量和位置改變，使得MS2 VLP能夠包裝2000 nt以上的外源RNA。研究者采用雙質粒共表達系統在大腸桿菌內表達了含6個基因片段［SARS-CoV1、SARS-CoV2、SARS-CoV3、禽流感基質蛋白基因（M300）和H5N1型禽流感（HA300）基因片段］共2248 nt的VLP[17]。采用單質粒雙表達系統在大腸桿菌內能夠將長度達到3024 nt的外源病毒RNA成功包裝到MS2 VLP內[14]，此長度的外源RNA已很接近野生型MS2基因組RNA（3569 nt）。雖然目前不能確定3569 nt是否是MS2 VLP包裝外源RNA的長度極限，但筆者研究發現，隨著包裝外源RNA長度的增加，相應的包裝效率會下降。

1.2 用于實時動態監測活細胞內RNA的運動

衣殼蛋白和包裝位點特異性結合的特性還被廣泛用于實時動態監測活細胞內RNA的運動，如小鼠白血病病毒的RNA轉運和HIV-1 RNA動態轉錄、包裝過程等[18-23]。RNA實時動態監測系統是使用基因克隆技術，將MS2噬菌體衣殼蛋白與綠色熒光蛋白（GFP）融合表達，被監測的RNA分子上融合有多個串聯重復的MS2噬菌體衣殼蛋白的結合位點（包裝位點序列），當MS2-GFP融合蛋白與靶RNA共表達時，大量帶有GFP標簽的衣殼蛋白會與每個RNA分子上的包裝位點序列結合，在顯微鏡下形成明亮的熒光顆粒，進而能夠指示RNA的運動。

1.3 用于細胞內mRNA相關microRNA的鑒定

microRNA（miRNA）是一類長約19～24 nt的非編碼單鏈小RNA分子，人類miRNA在RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ的作用下轉錄成初級miRNA（pri-miRNA），在細胞核內被切割成約70 nt的miRNA前體（premiRNA），隨后pre-miRNA通過RanGTP/Exportin 5的轉運機制被運送至細胞質，進一步被切割加工為成熟的miRNA。在動物中，miRNA可通過與靶基因3′UTR區互補結合，抑制靶基因翻譯成蛋白質，進而在細胞、組織或個體水平上影響生物體的生長發育，并參與免疫反應[24]和多種疾病過程[25-26]。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一群長度為200～100 000 nt的RNA分子，具有mRNA樣結構，起初被認為是基因組轉錄的“噪音”，是RNA聚合酶Ⅱ轉錄的副產物，不具有生物學功能。然而，近年發現lncRNA參與X染色體沉默、基因組印記及染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾、核內運輸等多種重要的調控過程[27-30]。目前對lncRNA功能的研究才剛剛開始。Yoon等利用MS2衣殼蛋白和包裝位點結合的特異性，以lincRNA-p21為例，創造了一種被稱為MS2-TRAP（MS2-標簽RNA親和純化）的鑒定細胞內與RNA結合的miRNA方法[31]，鑒定了多種與lincRNA-p21結合的miRNA。他們構建了幾種質粒，包括表達含24個包裝位點的pMS2質粒、融合表達谷胱甘肽S-轉移酶（GST）和MS2 RNA結合蛋白及核定位信號（NLS）的pMS2-GST質粒、表達含24個包裝位點作為標簽的目的RNA的質粒pMS2-lin?cRNA-p21。pMS2和pMS2-GST共轉染小鼠胚胎成纖維細胞作為陰性對照，pMS2-lincRNA-p21和pMS2-GST共轉染小鼠胚胎成纖維細胞作為實驗組。轉染后，在細胞內形成RNP復合物MS2 RNA/MS2-GST和lincRNA-p21-MS2 RNA/MS2-GST。裂解細胞后用含有還原型谷胱甘肽的瓊脂糖珠子純化2種復合物，提取其中的RNA，用反轉錄實時熒光定量PCR擴增鑒定相關miRNA。

1.4 用于RNA遞送載體的研究

RNA可分為編碼RNA和非編碼RNA。編碼RNA即mRNA，是能夠編碼蛋白質的RNA；非編碼RNA是不編碼蛋白質的RNA，包括rRNA、tRNA、sn?RNA、snoRNA、lncRNA和miRNA等。MS2噬菌體為正義單鏈RNA噬菌體，因其衣殼蛋白二聚體能夠識別并包裝含有包裝位點的外源性RNA，進而形成MS2 VLP，因而可用于包裝編碼RNA，如抗原編碼mRNA、調節因子編碼mRNA、具特定生物活性蛋白編碼mRNA，還能包裝非編碼RNA，如反義RNA和miRNA等，可作為RNA疫苗和RNA遞送載體[32-34]。

MS2是正義單鏈RNA噬菌體，宿主細胞是大腸桿菌。天然MS2的基因組RNA為原核RNA。Leg?endre等在釀酒酵母細胞YPH499內表達了帶有MS2包裝位點的外源mRNA的MS2 VLP，并證實這些mRNA可在哺乳動物細胞內行使功能[10]。筆者利用單質粒表達系統，在釀酒酵母YPH499細胞內用MS2衣殼蛋白包裝了HIV-1 gag mRNA，形成了MS2 VLP，此VLP具有很好的耐DNase和RNase的特性[33]。提取RNA轉染哺乳動物細胞（293T細胞、CHO細胞）后可檢測到目的蛋白的表達。我們還進一步證實了純化的pMS-GAG VLP免疫BALB/c（H-2d）小鼠后可以誘導抗原特異性體液免疫應答[33]。以上研究說明，不僅原核表達的MS2 VLP能包裝外源性原核RNA，通過真核表達系統獲得的MS2 VLP還可用于真核mRNA的遞送。

反義RNA是與特異靶RNA（主要是mRNA）互補的RNA分子，可通過配對堿基間氫鍵作用與靶RNA的特定互補區域結合形成雙鏈復合物，抑制靶RNA的功能，從而調控基因的正常表達[35-36]。反義RNA不編碼蛋白質，因而其結構與真核mRNA不同，僅需要其序列與靶RNA序列互補即可，因此無論原核還是真核表達系統獲得的包裝有MS2噬菌體樣顆粒均可用于抑制相應靶mRNA的表達。魏葆珺等采用雙質粒表達系統，其中用pET28（b）載體表達MS2成熟酶蛋白和衣殼蛋白，通過RT-PCR獲得人HCV 1～389 bp cDNA序列，反向插入pACYCDuet-1表達載體，轉錄后可產生針對HCV 5'UTR和IRES區的反義RNA。2種重組質粒共同轉入感受態大腸桿菌BL21（DE3）后用IPTG誘導表達，形成了內含反義RNA的MS2 VLP。源于HIV-1的Tat轉導肽具有多種靶細胞，可直接與細胞膜相互作用將外源性分子轉入細胞內。Tat轉導肽發揮轉運作用的最短有效序列為47YGRKKRRQRRR57。將內含反義RNA的MS2 VLP與HIV-1 Tat47-57轉導肽通過化學交聯劑Sulfo-SMPB交聯，在Tat47-57轉導肽的作用下將VLP轉入含HCV-螢火蟲螢光素酶報告基因的Huh-7細胞發揮功能，展示出其用于病毒感染治療的潛力[32]。

新近研究發現，通過原核表達系統獲得的裝載有功能性pre-miR-146a序列的MS2噬菌體樣顆粒與Tat轉導肽交聯后可將其作為miRNA的新型遞送載體，能夠被HeLa、HepG2、Huh-7及外周血單核細胞攝取，pre-miR-146a能在細胞內被加工為成熟的miR-146a，使細胞內miR-146a濃度增加5倍以上，進而有效抑制下游靶基因的表達[34]。小鼠尾靜脈注射100 μg與Tat交聯的MS2 VLP后，可在小鼠外周血淋巴細胞、脾、肺、腎中檢測到高表達的miR-146a，致使自身抗體和總IgG水平下調[37]。以上研究證實了MS2 VLP還能夠作為miRNA體內遞送載體，有效地將miRNA遞送至靶細胞并發揮功能。

2 結語

綜上所述，MS2噬菌體衣殼蛋白與包裝位點結合特異性強，MS2噬菌體樣顆粒能夠有效保護包裝RNA不被RNA酶降解，被廣泛應用于RNA病毒核酸檢測的標準物質、校準品和質控品的研究。二者間結合的特異型可作為細胞分子生物學研究的工具，如對活細胞內功能性RNA實時動態監測和細胞內轉錄RNA相關miRNA的鑒定。通過真核細胞表達系統化獲得包裝外源功能性蛋白質編碼mRNA，如抗原編碼mRNA、調節因子編碼mRNA、具特定生物活性蛋白編碼mRNA，在疫苗和基因轉運等研究方面亦具有重要的應用價值。此外，如通過分子克隆技術對MS2衣殼蛋白進行改造，將諸如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列（整合素αⅤβ3特異識別的配體結構）的腫瘤細胞靶向序列展示在MS2 VLP衣殼表面，獲得包裝有抑癌miRNA和/或抑癌lin?cRNA的MS2 VLP，不僅會實現腫瘤細胞的靶向性，還能通過多個靶點抑制腫瘤細胞生長或殺死腫瘤細胞，有可能給腫瘤的基因治療帶來新的突破，并為miRNA藥物治療相關載體的構建、病毒感染、遺傳病等的治療研究帶來新的思路。

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